Name: generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Bu çalışma, Hücresel Tedaviler (sözleşme NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), Hücre tabanlı Terapi İhtisas Merkezleri Üretim Yardım tarafından desteklenen hibe NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), bir ASBMT Genç Araştırmacı Ödülü (UG ve OG), Klinik Araştırma Ödülü (UG) Lösemi ve Lenfoma Derneği Özel Üyesi ve Amy Strelzer Manasevit Scholar Ödülü (AML).

1. DC nucleofection <ol><li> Hücre Genix IL4 (1000U/ml) ile desteklenmiş Medya, GMCSF (800IU/ml) ve DC olgunlaşma sitokinler IL4 (1000U kullanarak 24 saat için daha olgunlaşmış kullanarak 5 gün boyunca plastik bağlılık kültürü ile zenginleştirilmiştir Hasat monosit türevli DC&#39;lerin, / ml), 3ml transfer pipet yardımıyla yumuşak tabanda GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10 ng, IL1-β 10 ng ve PGE2 (1μg/ml) 1,. </li><li> Tripan mavi, en az 6 0.5x10 daha 3x 15ml tüp içine transferi ve daha 2x10 6 hücre / tüp kullanarak yaşayabilir DC&#39;ler Sayısı. </li><li> 10mins @ 200g DC&#39;ler Santrifüj. Üç kuyu, 37 ° C / 5% CO 2 inkübatör plaka tedavi 12 iyi doku kültürü 2ml/well - Bu süre içinde ön-sıcak Hücre Genix medya DC olgunlaşma sitokinler (DC olgunlaşma medya) ile desteklenebilir . </li><li> Hücreler bir kez iplik bitirdikten süpernatant aspirat ve 5μg DNA / tüp nihai bir konsantrasyon tüplerin her biri için ilgili DNA plazmid ekleyin. Bu durumda plazmid kodlama tüp IE1 pp65 # 1, tüp Hexon Penton # 2, ve tüp # 3 EBNA1-LMP2-BZLF1 ekleyin. </li><li> Amaxa nucloefection çözüm 100μl ile yeniden süspanse DC&#39;ler ve DNA, iyice karıştırın ve nucleofection küvetler transfer. </li><li> 4D nucleofector Yeri küvetler, program CB150 (Amaxa / Lonza) seçin ve start tuşuna basın. </li><li> Nucleofection küvet 2ml önceden ısıtılmış Hücre Genix DC olgunlaşma medya 500μl eklemek hemen sonra, prewarmed kalan 1.5 ml&#39;lik hazırlanan 12 plaka için aşağı yukarı 2-3 kez ve transfer nucleofected DC&#39;ler pipetleme ve hafifçe karıştırın DC olgunlaşma medya. 37 Transfer ° C /% 5 CO 2 inkübatör, bir başka 12-18hrs . </li></ol> 2. T hücre uyarımı <ol><li> Hasat ve 30Gy az nucleofected DC&#39;ler sayımı, ve ışın tedavisi. CTL orta 10ml ile (% 45 RPMI,% 45 Tıklanma EHAA,% 10 FBS, 2mm Glutamax) ve CTL medya ml&#39;de tekrar süspansiyon @ 3 x 10 5 DC&#39;ler ile bir kez yıkayın . </li><li> Havuz 7.5x10 5 (2.5ml) ve her içeren plazmid DC&#39;ler 15x10 5 (5ml), maksimum ve minimum toplanmış DC&#39;ler sonra kuvöz içinde yer alacak G-Rex cihaza aktarmak. </li><li> Cevapçı hücrelerinin hazırlanması için önceden dondurulmuş PBMC&#39;ler veya DC seçimi (yapışma veya CD14 seçimi) sonra kalan yapışmaz mononükleer hücreler ya kullanın. Hücrelerin çözülme, prewarmed kültür ortamına transfer CTL medya ile bir kez yıkayın. CTL Medya hücrelerinin yeniden süspanse hücre sayımı ve ml&#39;de 2x10 6 hücre konsantrasyonu getirin. Ve 300ng IL7 (10 ng - son derişim) - 30000U IL4 (son kons 1000U/ml) ile 15x10 6 hücre veya 7.5ml ve ek çekin. </li><li> PBMC 7.5ml (15x10 6 hücre), G-Rex ve medya ile toplam hacim 30ml bir CTL biyoreaktör kontör transferi . </li><li> Kültür G-Rex 6-7 gün süreyle 37 ° C /% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör. </li></ol> 3. T hücre genişletme <ol><li> Günde 6-7, medya aspirat 10ml, 10ml pipet ile medya kalan 20ml hücrelerin karışımı ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri saymak. Varsa &lt;50x10 6 taze medya + sitokinler ile doldurmak. &gt; 50x10 6 hücre varsa, hücre süspansiyonu 10ml kaldırmak, yeni bir G-Rex transferi, ve sonra taze CTL medya + sitokinler ile hem de G-Rexs beslemek . </li><li> Kültür ek olarak 4-6 gün. Yeterli hücre ileride kullanmak üzere CTL ve cryopreserve fazla fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek genişletilmiştir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: FDA onaylı multivirus spesifik CTL nesil sürecinin şematik Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, virüs-reaktif T hücreleri uyarmak için adenovectors ve EBV-LCL kongre multivirus CTL protokollerin aksine 2 DNA plazmid ile bulaşıcı bir virüs malzeme yerini almıştır 3 virüsleri her türetilen birden fazla antijene kodlamak. Biz üç multicistronic EBV plazmid kodlama Hexon ve Penton adenovirüs, IE1 ve pp65 CMV ve EBNA1, LMP2 ve BZLF1 trivirus CTL uyarmak için tasarlanmıştır. Bu antijenler, kendi ve T hücreleri İlan-hexon ve Penton 2,4-6 yöneltilmiş ve CMV-1E1 ve CMV pp65 in vivo 7 koruyucu gösteren diğer grupların klinik sonuçlar cesaret göre seçilmiştir. EBV, EBNA1 bir immünodominant CD4 + T hücre hedef antijen EBV ile ilişkili maligniteler ve EBV ile enfekte olan B hücreleri, normal ifade 8,9, LMP2 birden fazla HLA tipleri arasında immünojenik ve çoğu EBV maligniteler ifade 10,11 BZLF1 süre en bireyler hem CD4 + ve CD8 + T hücreleri uyarır ve işbirliği için büyük olasılıkla önemli olduğunu immünodominant, derhal erken litik döngüsü antijeni kodlayanvirüsü 12 kopyalayan hücreleri ntrol. Üretim yöntemleri daha da optimize etmek için CTL stimülasyon 13,14 minimalized, antibiyotik (FDA-uyumlu) plazmid oluşturulan Doğa Teknolojisi ile işbirliği yaptı. IFNγ ELISPOT ile ölçülen gibi optimize edilmiş DNA plazmid yanıt virüs spesifik T hücrelerinin sıklığı, daha fazla olduğunu, yüksek hücre canlılığı (veriler gösterilmemiştir) 3. Şekil 2 korurken, bu stratejiyi kullanarak sürekli olarak&gt;% 35 nucleofection verimi sağlamak aynı antijenleri (n = 8 Adenovirüs, n = 4, CMV ve n = 2 EBV) ifade geleneksel pShuttle tabanlı ifade plazmid yanıt daha. DC optimal oranı: R oranı (n = 2 vericileri): hücre, Şekil 3&#39;te 1:50 &#39;lik bir oran 1:20 G göre sub-optimal aktivasyon görüldüğü gibi güçlü bir T hücre uyarılması için önemliydi . Üretim geniş antijen özgüllüğü yeterli CTL numaraları üç virüslere karşı klinik etkinliği için bir ön koşuldur. Bu, kültürleri artar IL4 ve IL7 ek olarak repertuar ve özgüllüğü ise Şekil 4B gösterilen, geleneksel 24-kuyucuğu (Şekil 4A) 15 ile karşılaştırıldığında üstün T hücre genişlemesini destekliyor G-Rex, CTL kültürü ile elde CMV pp65-türevli HLA-A2 karşı reaktif T hücrelerinin sıklığı resticted NLV peptid IL4 ve / veya IL7 16,17 varlığı ya da yokluğu oluşturulan kültürlerde değerlendirildi. Dondurulması / infüzyon için nihai ürün üzerindeki akım sitometri analizi gerçekleştirmek genişletilmiş hücreleri, hücre içi sitokin boyama / IFNγ ELISPOT, ve Cr 51 serbest deneyleri fenotip ve fonksiyonel kapasitesini değerlendirmek için. Tipik olarak oluşturulan hücreler CD4 + ve hem de T hücre bölümlerinde algılanabilir antijen-özgüllük ile CD8 + T hücreleri karışık bir nüfusa sahip poliklonal. CTL in vivo (Şekil 5) graft-versus-host hastalığı (GVHH) neden olmaması gerektiğini belirterek, virüs kısmen HLA uyumlu hedefler negatif viral antijen-ifade hedef hücreleri öldürmek ancak bunlarla. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 rCTL ​​nesil protokol. Birincisi, DC&#39;ler viral antijen-kodlama plazmid nucleofected ve ardından otolog PBMC bir R ile karışık: S 10 veya 20:01. Hücreler, sonra hasat edilmiş sayılır, işlev, kimlik ve sterilite için test ve daha sonra klinik kullanım için Kriyoprezerve IL4 ve IL7 varlığı için 10-14 gün, G-Rex genişletilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Optimize edilmiş DNA plazmid, in vitro üstün T hücre aktivasyonuna neden olur . DC&#39;ler optimize edilmiş, FDA uyumlu plazmid kodlama Hexon ve Penton (İlan), IE1 ve pp65 (CMV) ve EBNA1, LMP2 ve BZLF1 (EBV) veya aynı antijenleri kodlayan geleneksel pShuttle plazmid nucleofected. Bu T hücreleri uyarmak için kullanılır ve özgüllük IFNγ ELISPOT 10 gün stimülasyon ile analiz edildi. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 Optimal DC: CTL aktivasyonu için T hücre oranları. Üç optimize plazmid 2 vericilerden DC&#39;ler nucleofected ve sonra, 01:20 ya da 01:50 DC otolog PBMC teşvik etmek için kullanılır: PBMC oranı. IFNγ ELISPOT tarafından 10 günde yeniden T hücrelerinin sıklığı değerlendirildi. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 artırılması sitokinler kullanarak G-Rex T hücre genişletme. Panel A, G-Rex cihaz yanı sıra mikroskopi tarafından değerlendirilir gaz geçirgen zar, CTL görünüm gösterir. Plakalar vs G-Rex tedavi kongre doku kültürü elde hücre çıkış arasında bir karşılaştırma da gösterilmiştir. B Paneli CMV pentamer olumlu CTL sitokin, tek başına IL4, IL7 yalnız ve IL4 + IL7 varlığı genişledi kültürleri elde sıklığını gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5. Genişletilmiş CTL fenotipi ve fonksiyonu. Ve CD8 + - Panel A CD4 + (yardımcı 45%) karışımı ile poliklonal genişletilmiş multivirus CTL, fenotipi bir temsili örnek gösterir (% 42 - sitotoksik) çoğunluğu (% 95) ifade olan T hücreleri, bellek işaretleyici CD45RO + / CD62L +. Paneli Yatak bu hücrelerin tüm uyarıcı antijenleri için spesifik olan ve IFNΓ, üretim ve antijen uyarımı sonrası TNF tespit hücre içi sitokin boyama tarafından değerlendirilir olarak polifonksiyonel vardır ki gösterir. Panel C genişletilmiş CTL ölçülen işlevsel olduğunu gösteren Cr 51 yöntemi ile. Otolog LCL, tek başına ya da CMV pp65 ifade eden bir boş vektör ya da bir adenoviral vektör ile transduced tar olarak kullanıldıolur. Alloreactivity allojenik PHA patlamalar kullanarak bir hedef olarak değerlendirildi.

<ol>
	<li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function:+a+cautionary+tale.">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li><li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals.">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li><li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host.">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy.">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation.">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li><li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells.">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li><li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4(+)+T-helper+1+responses.">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li><li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBNA1-specific+CD4++T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function.">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li><li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma.">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li><li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans:+lessons+from+Epstein-Barr+virus.">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li><li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response.">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li><li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system.">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li><li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pDNAVACCultra+vector+family:+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids.">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li><li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+(G-Rex.">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , (2009).</li><li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li><li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes.">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li><li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation.">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li><li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+cytomegalovirus+(CMV)-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy.">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li><li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li></ol>

Juan F. Vera Wilson Wolf Üretim için bir danışman. Diğer yazarlar ilgili açıklamalar var.

Viral enfeksiyonlar, hastalığı veya tedavisi immün sistemi baskılanmış hastalarda önemli bir morbidite ve mortalite oluşturmaktadır. HSCT sonra, örneğin, EBV ve CMV yanı sıra Respiratuvar Sinsityal Virüs (RSV) gibi solunum yolu virüsleri gibi kalıcı herpesvirüslerinin kaynaklanan enfeksiyonlar, iyi bilinen, İlan, BK virüs neden olduğu enfeksiyonların önemi ve insan herpes virüs (HHV) -6 daha takdir edilmiştir. Farmakolojik ajanların bazı enfeksiyonları için standart tedavi olmasına rağmen, önemli toksisiteleri, dayanıklı türevleri üretmek, ve sık sık etkisiz kalmaktadır. Buna karşın, kök hücre donörlerden elde edilen virüs spesifik T hücrelerinin hemopoietik kök hücre nakli, viral enfeksiyon veya hastalık (HSCT) ayarı 2,5,6,18-21 önlenmesi ve tedavisi için güvenli ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, T hücre immünoterapi geniş bir uygulama sonuçta CTL üretimi için gerekli olan maliyet, karmaşıklık ve zaman ile sınırlıdır. Multivirus CTL, mevcut elyazması açıklanan oluşturmak için yeni ve hızlı bir yaklaşım önemli ölçüde bağışıklığı baskılanmış konak için standart bir tedavi haline strateji sağlayarak, sitotoksik T hücre tedavisi viral hastalıklar için fizibilite artırmanız gerekir. APC&#39;ler plazmid nucleofected DC&#39;ler kullanımı farklı DC popülasyonları her plazmid 3 için kullanılmaktadır beri tek bir hücre içinde ifade birden çok viral antijenler viral vektörler ya da gerçekten rekabet olmadan MHC sınıf I ve II antijen sunumu sağlar. IL-4 / 7 artar, buna 16,17 antijen-spesifik T hücrelerinin yanıt sıklığı ve repertuar artmasına yardımcı olur T hücre sağkalım ve proliferasyon, kullanın . Son olarak, G-Rex kültürü önemli ölçüde kültür sırasında T hücre apoptozis azaltır. Gaz değişimi (O 2 ve CO 2 çıkışı), hücreler üzerinde daha derin bir orta izin verirken hipoksi önlenmesi, daha fazla besin ve atık ürünlerin seyreltilmesi, balonun tabanındaki bir gaz geçirgen silikon zarından oluşur . Bu platform, aynı zamanda ek virüslere karşı koruyucu antijenler olarak tanımlanır uzatılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> İnsan AB serum </td><td> Valley Biyomedikal Inc. </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B &amp; AAF-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kiti </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Plazmidler </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> Ar-Ge </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> Ar-Ge </td><td> 201-LB-025 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> Ar-Ge </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNF </td><td> Ar-Ge </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Sigma </td><td> P6532-1MG </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Wilson Kurt Üretim </td><td> AY11-00.027 </td></tr></tbody></table>

generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant

Viral enfeksiyonlar, allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) alıcıları morbidite ve mortalite neden olur. Biz ve diğerleri başarılı bir şekilde oluşturulur ve Ebstein Barr virüsü (EBV), sitomegalovirüs (CMV) ve Adenovirüs (İlan) monositler ve T-hücrelerinin özel infüze EBV-dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre (EBV-LCL) adenovirüs vektör ile gen-modifiye antijen sunan hücreler (APC). / Kg gibi az 2x10 5 trivirus spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) infüzyon birkaç günlükler sonra çoğaldı ve mevcut diğer tedavilere dirençli, hatta ciddi bir viral hastalıktır önlemek ve tedavi etmek için ortaya çıktı. Hazırlanması için geniş bir uygulama bu teşvik edici bir yaklaşım, yüksek üretim maliyetleri, üretim karmaşıklığını ve uzun bir süre (toplam 10-14 hafta CTL üretimi için EBV LCL nesil, ve 4-8 hafta 4-6 hafta) ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları aşmak için yeni bir GMP uyumlu CTL üretim protokolü geliştirdik. Birincisi, biz, antijen sunan plazmid DNA kodlaması LMP2, EBNA1 ve BZLF1 (EBV), Hexon ve Penton (İlan), pp65 ve IE1 (CMV) ile nucleofected dendritik hücreler (DC) T hücreleri uyarmak için adenovectors yerine hücreleri. Bu APC tüm uyarıcı antijenler için spesifik T hücrelerinin yeniden etkinleştirin. İkincisi, kültür varlığında IL-4 T-hücrelerinin aktive (1.000 U / ml) ve IL-7 (10 ng) artırır ve bizim çizgiler spesifik T hücrelerinin repertuar ve frekans sürdürmektedir. Üçüncü olarak, biz, böylece EBV-LCLs şartının kaldırılması ve teknisyen müdahale azaltarak, tek bir stimülasyon sonra büyük hücre sayıları genişleme ve hayatta kalma teşvik yeni bir gaz geçirgen kültür cihazı (G-Rex) kullanılır. Bu değişiklikler uygulayarak şimdi 10 6 hücre&gt;% 90 azalır başı maliyetle, EBV, CMV, ve İlan hedefleyen multispecific CTL üretmek ve ek için uzatılabilir bir yaklaşım kullanarak sadece 10 gün yerine 10 hafta Koruyucu viral antijenler. Değeri yüksek risk allojenik HKHT alıcıları için profilaktik ve tedavi uygulamaları için FDA onaylı bir yaklaşım olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...