Name: vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals at JoVE.com

ברצוננו להכיר בני הזוג. פינג יוני Zhu ו סוסומו Koyama על סיועם במהלך הראשונית להגדיר של הטכניקה, וד&quot;ר ורוניקה אלווארז לסיוע עיצוב את כתב היד נכתב. מחקר זה מומן על ידי המחלקה למחקר קליני ביו עירונית של NIAAA.

<ol>
	<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala.">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li><li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology.">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li><li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron.">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li><li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area.">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li><li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons.">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li><li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron/synaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area.">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li><li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons.">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity.">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li><li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron/bouton+preparation.">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Vibrodissociation מוצלח דורש כי פרוסות מכילים נוירונים בריא כי רווחים ביניים גמישים מספיק כדי לאפשר נוירונים כדי לצאת ללא נזק פרוסה רעילים. לכן, השיטה עובדת בצורה אופטימלית בגיל מוקדם לאחר הלידה (P1-21) כאשר פרוסות בריא יכול להתבצע עם חומר גליה פחות / interstiatial מאשר נמצא פרוסות המוח הבוגר. מניסיוננו, לעומת זאת, אופטימיזציה הכנה פרוסה להישרדות העצבית פרוסה עצמו עשוי להיות מועיל עבור הטכניקה vibrodissociation. הואיל ואנו שגרתי להכין פרוסות עבור הקלטה באתרו באמצעות aCSF שונה קר שבו סוכרוז כבר להחליף הרבה של תאי Na + ו - Ca 2 +, פרוסות מוכן vibrodissociation יכול להיות מוכן (חתך למשל) ב aCSF הקלטה הרגיל שלנו. בעת הכנת פרוסות הקלטה מתא עצב בודדים את פרוסות עצמם יש לנו גם מקום פרוסות aCSF נורמלי ב 35 ° C רק לאחר חתך ולהשאיר אותם במשך 30-60 דקות בטמפרטורת זה לפני החזרה אותם לטמפרטורת החדר. עם זאת, פרוסות מוכן vibrodissociation מועברים מיד לטמפרטורת החדר מיד לאחר חיתוך. נהלים אלה לספק תשואה גבוהה יותר של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation, אולי בשל חוסר של רקמת חברת ביניים המאפשר נוירונים להיות מזועזע בקלות רבה יותר משוחרר מכל פרוסה עצמו. אנחנו לא בחנו ממצה הכנה התנאים פרוסה, כפי שאנו שגרתי להשיג נוירונים מספיק הקלטה שלנו ניסויים הדמיה ביום נתון. יתכן כי שינויים נוספים, כגון שינויים עובי פרוסת או נהלים preincubaton, יכול להיות עשוי להגדיל את התשואה של נוירונים בריא. טיפולים פרוטאז קלה מאוד נוסו במאמץ להגדיל את תפוקת התא ולקבל את הטכניקה לעבוד אצל בעלי חיים מבוגרים יותר. עם זאת, תמיד אפילו טיפול פרוטאז קלה נראה לשבש תפקוד הסינפסה. וכך, בעוד השילוב של פרוטאז מכני דיסוציאציה עדיין עשויים למצוא עבודה זה לא הוכיח אמין בנוירונים forebrain עד כה. ראוי גם לציין את התשואה הנמוכה יחסית של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation כלומר טכניקה זו שימושית בעיקר ללימוד תת נוירונים בשפע, בעיקר נוירונים ההקרנה. הזמינות של ה-GFP-לבטא בעכברים שבהם subpopulations עצבי קטן ניתן לזהות בקלות מגדיל את הסיכוי של לימוד נוירונים אלה נדירים. עם זאת, אם התשואה העצבית ניתן לשפר במידה ניכרת הצטברות של נתונים על הנוירונים האלה עשוי להיות איטי יחסית. צעדים אחדים הוכיחו להיות מכריע עבור טעינת מוצלח של נוירונים עם סידן חישה צבעים. חשיפה לצבוע AM-esterified מבוצע על 37 ° C, ואנחנו לא הצליחו מנסה לצבוע עומס בטמפרטורות נמוכות יותר. ריכוז של צבעים צריך להיות מותאם בהתחשב הן זמן הטעינה והטמפרטורה מאז נראה כי ריכוז גבוה של העמסה, לצבוע מוריד ריכוז סידן boutons presynaptic. ראינו כי הטעינה עם ריכוזים גבוהים יותר מקטין את תדירות את המשרעת של sIPSCs. בעת טעינת סידן חישה צבעים לתוך מסופי presynaptic של נוירונים vibrodissociated, יש להקפיד כי קיבולת חציצה של boutons presynaptic קטן עשוי להיות שונה מזה של סומה ואת הגדלים של boutons אינן עקביות. Neuron המכילים מנות נשטפים עם פתרון HEPES שנאגרו חיצוני הטעינה הבאה, צבע, ואת זמן ההחלמה לאחר כביסה הוא קריטי. בנוסף, כדי להפוך את חותם טוב הקלטה שלם תאים, התאים יש לרחוץ ביסודיות להיפטר הלא הפנימו מולקולות צבען של קרום התא החיצוני. בנוסף לשימוש נוירונים vibrodissociated הדמיה תא electrophysiology ולחיות, טכניקות immunocytochemical יכול להיות מיושם גם על תאים אלה 11,12. תאים ניתן לתקן בקלות ומוכתמת עם מגוון רחב של נוגדנים, וסמנים תאים אחרים. השימוש בתאים אלה מספק הכנה נקי להדמיה של ביטוי החלבון מסופי presynaptic GABAergic. שימוש בעכברים המבטאים חלבוני ניאון בשליטת היזמים ספציפית נוירונים GABAergic מאפשרת לחוקר לזהות המסופים הסינפטיים הפרט בהכנת vibrodissociated (איור 1). סמנים הדמיה פלורסנט מסוג זה עשוי לאפשר מדידות מורפולוגיים באמצעות מסופים מבוססי לייזר מיקרוסקופיה וטכניקות חדשות יותר כמו STED (פליטה גירוי מיקרוסקופית דלדול). ויזואליזציה עם צבעים כי הדו&quot;ח אופניים שלפוחית ​​סינפטית הוא גם אפשרי עם הכנה זו. Akaike ועמיתים לעבודה יש שכותרתו מסופי GABAergic עם צבע styryl, FM1-43 לדמיין מסופי בתאים חיים 4. זה צריך להיות גם ניתן לבצע תא בודד הפוכה transcriptase PCR ביטוי RNA פרופיל vibrodissociatedנוירונים. טכניקה זו מיושמת באופן שגרתי enzymatically-ניתק נוירונים נוירונים גדל בתרבות התא.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> רטט כלי פריסה רקמות </td><td> לייקה מיקרוסיסטמס </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> תרבית תאים תבשיל (35 מ&quot;מ) </td><td> BD פלקון </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> תחתית זכוכית מנות </td><td> Willco-צלחת </td><td> GWSB-5040-3522 או GWSB </td><td> 0.16-0.19 מ&quot;מ עובי זכוכית הדמיה </td></tr><tr><td> פיזואלקטריים Manipulator </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> אפשר גם להשתמש ממסר וכו &#39; </td></tr><tr><td> SD9 כיכר דופק ממריץ </td><td> גראס טכנולוגיות </td><td> SD9K </td><td> מפעילה מניפולטור פיזואלקטריים </td></tr><tr><td> הביתור Stereoscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> Typ 374590 </td><td> אפשר גם להשתמש בכל stereoscope </td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> קיר זכוכית דק נימים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> TW-150F-4 </td><td> עבור להבה זכוכית אטום micropipette ו תיקון micropipette </td></tr><tr><td> ששת זלוף ערוץ שסתום בקרה </td><td> וורנר מכשירים </td><td> VC-6 או VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> זלוף Fast-Step </td><td> וורנר מכשירים </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הפוך עם 20-63x יעדים </td><td> ניקון </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD מצלמה </td><td> אנדור טכנולוגיה </td><td> iXon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite תאורה פלואורסצנטי מקור האור </td><td> EXFO Photonics פתרונות בע&quot;מ </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM אינדיקטור סידן </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation of neurons from rodent brain slices to study synaptic transmission and image presynaptic terminals

מכונות דיסוציאציה של נוירונים ממערכת העצבים המרכזית יש את היתרון כי boutons presynaptic להישאר מחובר נוירון בודד של עניין. זה מאפשר בדיקה של שידור הסינפטי בתנאים שבו סביבות תאיים תאי ו postsynaptic ניתן לשלוט היטב. טכניקת הרטט מבוססי ללא שימוש פרוטאזות, המכונה vibrodissociation, היא הטכניקה הכי פופולרי עבור בידוד מכני. Micropipette, עם קצה אש מלוטשת לצורת כדור קטן, מכניסים פרוסת המוח עשוי מכרסם P1-p21. Micropipette הוא רטט במקביל פני פרוסת והוריד דרך עובי פרוסת והתוצאה היא שחרור של נוירונים בודדים. נוירונים בודדים מוכנים ללמוד בתוך דקות ספורות של vibrodissociation. טכניקה זו יתרונות על פני השימוש של תרבויות העצבית העיקרי, פרוסות המוח נוירונים בודדים enzymatically כולל: ייצור מהיר של נוירונים קיימא בוגרת יחסית מתאים מחקרים אלקטרו הדמיה, שליטה מעולה של הסביבה תאיים ללא השפעה של תאים שכנים, התאמתו עבור מבוקר היטב ניסויים תרופתי באמצעות תרופות יישום מהיר הכולל תא superfusion; ושיפור חלל מהדק כולה תא הקלטות יחסית נוירונים פרוסה או תרבות ההכנות התא. הכנה זו יכולה לשמש כדי לבחון הפיזיולוגיה סינפטית, פרמקולוגיה, אפנון הפלסטיות. בזמן אמת הדמיה של שני אלמנטים טרום postsynaptic בתאים boutons החיים ניתן גם באמצעות נוירונים vibrodissociated. אפיון המרכיבים המולקולריים של יסודות טרום postsynaptic יכול גם להיות מושגת עם גישות אימונולוגיות הדמיה מבוססת.

Watch this Scientific Journal Video about Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals at JoVE.com

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

דו&quot;ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

דופמין Dynamics Presynaptic בתוך פרוסות המוח striatal עם Voltammetry סריקה מהירה מחזורי

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...