Name: axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NSF CARRIERE cbet-0747615. De auteurs willen Drs bedanken. Douglas H. Smith en David F. Meaney voor hun mentorschap en ondersteuning.

1. Overzicht van de Axon Stretch Growth Bioreactor System <ol><li> Twee overheersende benaderingen zijn gebruikt om experimentele krachten van toepassing zijn op neuronen. In de eerste benadering, zijn krachten toegepast op de gehele neuron (Lu, Franze et al., 2006;. Chetta, Kye et al. 2010;.. Lindqvist, Liu et al. 2010). In de tweede benadering, zijn krachten direct op het axon door te trekken op de groei kegel. Met behulp van glas naalden, heeft deze laatste benadering is gebruikt om het model de vorming van nieuwe axon (Bernal, Pullarkat et al. 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al. 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al. 2010), te dwingen drempels voor rek te identificeren en retractie (Dennerll, Lamoureux et al. 1989;. Zheng, Lamoureux et al. 1991;.. Lamoureux, Zheng et al. 1992), naar neurotransmitter clustering en te analyseren in axon terminals (Siechen, Yang et al. 2009.). Een unieke tissue engineering uitbreiding van deze methode is ontwikkeld om grote zenuw produceren construeert met behulp van een geautomatiseerd Axon Stretch Growth (ASG) bioreactor systeem (Iwata, Browne et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Onlangs ontwikkelden we een geminiaturiseerde versie van de bioreactor systeem om te studeren ASG microscopisch in real time (Loverde, Ozoka et al.. 2011). Hier hebben we detail de 9-daagse protocol (tabel 1) we momenteel gebruiken om bioreactoren voor te bereiden en ASG routinematig uit te voeren. </li><li> Overall Werking: Het ASG bioreactor systeem bestaat uit drie hoofdcomponenten, 1) een bioreactor kamer met onafhankelijke rijstroken (langwerpige putten) waar neuronen worden gekweekt en uitgerekt, 2) een geautomatiseerde lineaire beweging tafel om stretching krachten en 3) een stappenmotor toe te passen aandrijving controller met software op te rekken groei (figuur 1) te controleren. </li><li> In het kort werd de fabricage van bioreactor prototypes uitgevoerd in een werkplaats met behulp van een verticale freesmachine (Bridgeport, Elmira, NY). Voor biocompatibiliteit, het gemak van sterilisatie en duurzaamheid, zijn de interne bioreactor componenten vervaardigd uit 3 / 8 &quot;polyetheretherketone (PEEK). Transparant polycarbonaat werd gebruikt voor deksels om voor licht microscopie en bekijken van culturen. Corrosiebestendig 316 roestvrij stalen schroeven en de hardware te voltooien de montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> De bioreactor kamer bestaat uit een frame dat zich uitstrekt drie rijstroken, een instelbare sleep-blok dat cellen over de rijstroken manipuleert, en uitstekende slepen staven vormen voor externe manipulatie (figuur 2). Neuronale culturen zijn uitgeplaat op wegwerp Aclar slepen cultuur substraten gesteund door het trekkende blok (figuren 2 &amp; 3). Een wegwerp dekglaasje stationair ondergrond hecht aan de onderkant van het frame en stretching omvat alle drie rijstroken. Voorafgaand aan stretching, moet plated neuronen te breiden axonale processen van het trekkende substraat op de stationaire substraat via groeikegel extensie. De bevolking van axonen die brug de substraten vervolgens zal strekken ondergaan door het beheersen van verplaatsing van het trekkende blok. </li><li> De geautomatiseerde lineaire beweging tabel bestaat uit een stappenmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) en de lineaire beweging tafel (MIPS-2-10-1,0 mm, Servo Systems, Monteville, NJ), gemonteerd op een delrin alignment tafel . De bioreactor kamer zit in de tabel parallel aan de lineaire beweging tafel. Het trekkende staven dat zich uitstrekt van de bioreactor kamer zijn bevestigd aan de lineaire beweging tafel met behulp van een adapter. </li><li> De stap aandrijving controller (Si 2035, Applied Motion Products) is geprogrammeerd met behulp van de meegeleverde Si programmeur software om manipulatie van het trekkende substraten te controleren. Axonale stretch wordt toegepast op een stapsgewijze manier door het nemen van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al., 2004;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Dit computergestuurde systeem biedt de mogelijkheid om aangepaste profielen voor ASG, en is essentieel voor continue experimenten gedurende enkele dagen tot weken. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Bioreactor Kamer <ol><li> Bereid de wegwerp sleep-en stationaire cultuur neuronale substraten voor cultuur: <ol><li> Slepen cultuur substraten worden gesneden van 8,5 &quot;x 11&quot; vellen Aclar film (33C 2,0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Met behulp van een scherp mes de substraten teruggebracht tot ongeveer 0,5 x 2,5 cm, of iets korter dan de breedte van de rijstroken ten minste 1-2mm speling laten aan beide kanten. </li><li> Licht zand de onderste 1 / 3 van het trekkende cultuur substraten aan beide zijden met fijn schuurpapier korrel 1200 (McMaster Carr). Schuren van het trekkende substraten faciliteert groei van axonen van het trekkende substraten op het dekglaasje stationaire substraat. </li><li> Snijd een 5 x 7cm stuk Aclar of gebruik een nummer 1 glas dekglaasje om te dienen als de stationaire substraat (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> Schoon ee cultuur substraten met een verdunde oplossing Alconox en grondig spoelen met gezuiverde dH 2 O. </li><li> Steriliseer de cultuur substraten door middel van onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 minuten. Laat de substraten te droge lucht in een steriele cultuur kap. </li></ol></li><li> Reinig de bioreactor kamer met verdund Alconox en autoclaaf gesteriliseerd in een autoclaaf container. Direct na het autoclaveren, over te dragen aan een steriele kap en aan de lucht laten drogen. </li><li> Te vervolgen binnen de steriele kap, lijm de cultuur substraten aan de bioreactor met behulp van Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) en steriele katoen getipte swabs (McMaster Carr): <ol><li> Met het trekkende blok benen in hun volle rechtop, lijm het trekkende cultuur substraten op de trekhaak te blokkeren benen bij de niet-geschuurde gedeelte. Vermijd contact met de geschuurde oppervlak cultuur. </li><li> Lijm de stationaire cultuur substraat op de bodem van de bioreactor kamer. </li><li> Verwijder overtollige lijm en luchtzakken door zachtjes indrukken van een droog wattenstaafje tegen de gelijmde substraten. </li><li> Sinds Siliconen RTV loogt azijnzuur dat giftig is voor neuronen, is de bioreactor links naar onder UV-licht drogen binnen de kap voor twee volle dagen voorafgaand aan de introductie van neuronale culturen. </li></ol></li><li> Hoe lager de slepen blok benen een 2-3mm overlap tussen de uiteinden van de geschuurde slepen substraten en de stationaire substraat te bereiken. Cruciale aandacht moet worden besteed aan de grootte van de overlap, als het te groot is, de uiteinden van het trekkende substraten kan uit afleiden van de stationaire substraat, vermindering van het aantal axonen die de overlap (figuur 3) span. </li><li> Plaats de sleep-blok aan de start positie, met het trekkende staven teruggetrokken in de bioreactor. Draai de immobilisatie schroeven om beweging van het trekkende staven voorafgaand voorkomen om de groei te rekken. </li></ol> 3. Neuronale Culturen <ol><li> Pool 1 ml van 10 ug / ml hoog moleculair gewicht poly-D-lysine (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-vrije media in de ondergrond raakvlak gebied van elke baan. Laat de oplossing ongestoord houden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel voorzichtig 3x met dH 2 O, gevolgd door een laatste spoelbeurt met cultuur media. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. </li><li> Isoleer achterwortelganglia explantaten (DRG) van een E16 rat pup. Met behulp van een stereomicroscoop, verdun het explantaten in druppels met behulp van petrischalen. Verzamel 3-4 explantaten met behulp van een 100 ul pipet en de plaat op de rand van de geschuurde slepen cultuur substraat. Zorg moet worden genomen om het bord van de explantaten aan de rand van het trekkende ondergrond met behulp van een kleine plas media. Tot 1 ml van de cultuur media per rijstrook is voldoende om verdamping te voorkomen gedurende enkele uren, terwijl het beperken van beweging van de explantaten. Media formulering: Neurobasal met B-27 + 0,5 mm L-Glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) en 20 uM FDU + 20 uM Uridine mitotische remmers (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Bevestig het deksel en breng de bioreactor naar een incubator voor een uur of tot cellen hechten. </li><li> Vul de bioreactor met cultuur media op het punt verste de explantaten om losraken te voorkomen. Incubeer de bioreactor voor een minimum van vijf dagen, terwijl neuronen uit te breiden axonale processen op de stationaire substraat. </li></ol> 4. Axon Stretch Groei <ol><li> De bioreactor ondergaat laatste voorbereiding procedures in een steriel kap: <ol><li> Vul reservoirs binnen de bioreactor met fosfaat gebufferde zoutoplossing om de kamer en beperken de verdamping van de cultuur media bevochtigen. In ons systeem, de uitgeholde behuizing muren dienen als reservoirs. Als alternatief kan petrischaaltje deksels worden geplaatst aan weerszijden van het trekkende blok boven op de cultuur van rijstroken. </li><li> Vervang de cultuur media en vul de rijstroken van de capaciteit. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. </li></ol></li><li> Plaats de bioreactor in de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. Als het experiment moet worden uitgevoerd binnen een incubator, mag het niet worden bevochtigd vanwege mogelijke corrosie van de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. </li><li> Bevestig het trekkende staaf-adapter op de trekhaak staven. </li><li> Met behulp van Si Programmer software jog de fase van de lineaire beweging tafel aan te sluiten bij het trekkende roede adapter en het bevestigen aan het podium. Voor het gemak, voor te bereiden Si Programmeur sequenties van te voren om het podium te manipuleren in specifieke stappen. </li><li> Draai de immobilisatie schroeven op de bioreactor kamer voor het vrije verkeer van het trekkende blok mogelijk te maken. </li><li> Stretch wordt toegepast in een stapsgewijs door het initiëren van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al.. 2006). Onze paradigma begint met het nemen van 2 micrometer stappen per 172 seconden,resulterend in een netto-1mm strekken zich uit over 24 uur. Na een dag, kan het traject snelheid opgevoerd worden door verhoging van de verplaatsing of het verminderen van de dwell time (tabel 2). </li><li> Zodra ASG is gestart, zijn media veranderingen meestal niet nodig. Na verloop van tijd echter, cultuur media wordt over het algemeen zuur en is duidelijk door een verandering in de geelachtige kleur. Als verdere experimenten nodig is, is oude media nooit helemaal leeg, maar in plaats daarvan slechts gedeeltelijk gewijzigd om trauma&#39;s te minimaliseren aan drijvende axonen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Axonale processen kunnen ondergaan opvallend snelle en robuuste stretch groei. In eerste instantie het proces begint met een periode van trage rek (≤ 1mm/day) dat bestaat uit kleine, onregelmatige verplaatsingen. Binnen de eerste 24 uur na stretching, mechanotransductie van neuronale groei paden treedt, waarbij neuronen beginnen naast de axon cilinder. Binnen de 24 uur van continue ASG, axonen vertonen een toenemende tolerantie voor een grotere en meer frequente verplaatsingen. In het algemeen kan axonen bestand tegen een verhoging van de rek snelheid van 1mm/day iedere 12-24 uur (Pfister, Iwata et al., 2004;. Pfister, Bonislawski et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Het verhogen van de stretch rate te snel, kan echter leiden tot een snellere groei van axonen te selecteren, maar zal ook leiden tot pathologische occlusie dat afsluiting veroorzaakt. Stretch groeiende axonen hebben de neiging om bundels vormen, die lijkt op de architectuur van bundels. Gebruik te maken van de huidige protocollen, de centrale, stretch gegroeid deel van de axon bundels hebben geen verklevingen aan de cultuur substraat. Alleen de in eerste instantie aangehouden, proximale en distale segmenten van stretch groeiende axonen gehecht blijven aan de cultuur substraten. Dienovereenkomstig, het centrale gedeelte van stretch gegroeid axonen zweven vrij, en gevoelig zijn voor verstoring gevolge van het behandelen. Om verschillende redenen kunnen sommige axonen niet groeien in de toegepaste stretch tarief. Bijvoorbeeld, een DRG neuron met twee axonale processen, die beide ondergaan stretch, misschien niet in staat zijn om voldoende eiwit te vertalen en op de toegepaste tarief stuk groeien. Axonen, die niet geschikt voor de toegepaste stretch zullen dunne volgende effect Poisson&#39;s. Latere rekken zal leiden tot occlusie van de axonen, remmen assemblage, wat leidt tot pathologische verbroken. Het merendeel van de axonen, zijn echter in staat om te ondergaan ASG succesvol en slechts een klein percentage van de axonen ondergaan deze snoeien-achtig proces. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figuur 1. Axon Stretch groei Bioreactor System. (A) Bioreactor cultuur kamer &amp; Automated lineaire beweging tafel, (B) Stap motor drive controller en Si Programming software. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figuur 2. Bioreactor Cultuur Kamer. Deze cartoon toont de bioreactor kamer van de top met verwijderde het deksel. De positie van het trekkende blok weerspiegelt het eindstadium van de axon stretch groei. Stretch uitgegroeid axonen kan gezien worden in bundels binnen de cultuur rijstroken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figuur 3. Voedingssubstraat Plating Interface. Deze cartoon toont de componenten van het trekkende mechanisme in elke baan van de bioreactor van zijaanzicht. (Top) De correcte overlap van het trekkende en stationaire cultuur substraten. (Onder) Overmatige overlap van het trekkende en stationaire substraten zorgt ervoor dat de tip van het trekkende substraat te krullen. Film 1. Bevestigen van Cultuur Substraten voor Bioreactor Kamer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 2. Plating van DRG Explantaten op Slepen Substrates. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 3. SiProgrammer gebruik. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 4. Groeikegel Uitbreiding op Stationaire Ondergrond. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 5. Axon Stretch Groei. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Klik hier om video te bekijken</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Dag </td><td> Stap </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilisatie &amp; Drogen </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Lijmen &amp; Montage </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Neuronale Cultuur Plating</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Stretch Groei Start </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Experiment Schema. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tijd [hr] </td><td> Stretch Prijs [mm / dag] </td><td> Dwell Time [s] </td><td> Totaal Lengte [mm] </td><td> Totaal Stretch tijd [dagen] </td></tr><tr><td> Pretentie </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Stretch Rate Schema. Alle stretch stappen zijn 2 micrometer in verplaatsing (10 stappenmotor stappen = 2 micrometer stretch).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration.">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li><li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth.">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li><li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions.">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li><li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon.">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li><li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces.">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li><li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+(Muller)+cells:+sensing+and+responding+to+tissue+stretch.">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li><li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons.">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , (2011).</li><li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair:+Surgical+Applications,+State+of+the+Art,+and+Future+Challenges.">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

De ex-vivo mechanische rek van neuronale cellen is gepatenteerd onder US patenten # 6264944 en # 7429267.

Twee cruciale stappen moeten worden genomen bij de voorbereiding van de bioreactoren. Eerst wordt een optimale overlap bij de substraat-interface die nodig is om ervoor te zorgen dat de axonen kunnen oversteken op de stationaire substraat. Aclar dat overmatig gekruld of anderszins onvolmaakt mag niet worden gebruikt (figuur 3). Voor het optimaliseren van de overlap, bevestigen dat het trekkende ondergrond gelijkmatig is geschuurd en contact met de stationaire substraat gelijkmatig over een 2-3mm lang contact met de weg. De overlap dient voorafgaand aan elk experiment worden geoptimaliseerd door het zorgvuldig aanpassen van de hoogte van het trekkende benen. Ten tweede, terwijl voor de bevestiging van neuronen, substraat coatings te ondersteunen aanzienlijke Sheering krachten veroorzaakt door de verplaatsing van de bioreactor en de contractiele de spanning van de axonen (Heidemann en Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al., 2004;.. Loverde, Ozoka et al. 2011). Ondergronden moeten grondig worden gespoeld met gesteriliseerd water zowel voor als na lysine coating. Coatings worden toegepast van vers ontdooide aliquots en verspreid zo gelijkmatig mogelijk te maken. Belangrijk is dat de ondergrond niet worden verplaatst of anderszins gestoord tijdens de hechting periode. In de daaropvolgende stappen, vermijd contact met de substraten tijdens het plating, en pipet alle oplossingen uit het verre uiteinde van de rijstroken uit de buurt van de ondergrond-interface. Toleranties in de aansluitingen van elk bioreactor component kan manifesteren in de vorm van speling. Tijdens de eerste periode van ASG, speling in het systeem is evident als beweging van de geautomatiseerde lineaire beweging tafel komt, zonder beweging van het trekkende blok. Slack kunnen variëren per experiment, maar is meestal &lt;1mm in onze ervaring. Om deze reden, een &quot;pre-spanning &#39;slappe eliminatiefase van 1mm/day, voor een dag, vooraf aan de ASG schema waarin de bioreactor onderdelen betrekken en beginnen met beweging van het trekkende substraten. Het oplossen van problemen kan nodig zijn als de verplaatsing stap van de automatische lineaire beweging tabel niet overeenkomt met de verplaatsing van het trekkende blok na de pre-spanning fase is voltooid. Asynchroon, onjuiste verplaatsingen van het trekkende blok worden geassocieerd met &#39;stiction&#39; of statische wrijving binnen het trekkende hardware en buigen van de adapter. Om te voorkomen dat deze problemen zich voordoet, moet beweging van het trekkende blok worden gecontroleerd met de hand, na montage, voor een soepele bijna moeiteloos beweging. Indien er bindende optreedt, dient het trekkende montage vooraf te worden vrijgelaten om te experimenteren. Voldoende stijfheid van de adapter is ook noodzakelijk om accurate, synchrone verplaatsingen te verzekeren worden niet overwonnen door stiction van het trekkende hardware.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de component </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Polyetheretherketone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Custom made bioreactor kamer </td></tr><tr><td> Polycarbonaat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Custom made bioreactor kamer deksel </td></tr><tr><td> Stappenmotor </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Lineaire beweging tafel </td><td> Servo Systems, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1,0 mm </td><td></td></tr><tr><td> Stappenmotor drive controller </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structuur Probe Inc, West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Slepen cultuur ondergronden </td></tr><tr><td> Nee een dekglaasje </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Stationaire cultuur substraat </td></tr><tr><td> Silicium RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Wattenstaafje swabs </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Tijdens de pre-synaptische embryonale ontwikkeling, neuronale processen traverse korte afstanden om hun doelstellingen te bereiken via groei kegel. Na verloop van tijd worden neuronale somata gescheiden van hun axon terminals als gevolg van groei van het skelet van de zich uitbreidende organisme (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al. 1992). Dit mechanotransductie leidt tot een secundaire vorm van neuronale groei die in staat van de opvang van voortdurende verlenging van het axon (Bray, 1984; Heidemann en Buxbaum 1994, Heidemann, Lamoureux et al. 1995;. Pfister, Iwata et al. 2004.). Axon Stretch Groei (ASG) is denkbaar een centrale factor in de rijping van korte embryonale processen in de lange zenuwen en witte stof traktaten kenmerk van het volwassen zenuwstelsel. Om te studeren ASG in vitro, hebben we ontworpen bioreactoren om de spanning van toepassing zijn op de korte axonale processen van neuronale culturen (Loverde, Ozoka et al.. 2011). Hier hebben we detail de methodes die wij gebruiken om bioreactoren voor te bereiden en ASG gedrag. De eerste, binnen elk rekken rijstrook van de bioreactor, zijn neuronen plated op een micro-gemanipuleerde slepen substraat. Vervolgens neuronen regenereren hun axonale processen, via groeikegel uitbreiding, op een stationaire substraat. Tot slot wordt de groei stretch uitgevoerd door slepen de vergulde cellichamen weg van het axon terminals gehandeld op grond van de stationaire substraat; indient groei van het skelet na de groei kegel extensie. Eerder werk heeft aangetoond dat ASG van embryonale rat achterwortelganglia neuronen in staat zijn van een ongekende groeicijfers tot 10mm/day, bereiken lengtes tot 10 cm, terwijl tegelijkertijd resulteert in een verhoogde axonale diameters (Smith, Wolf et al. 2001;. Pfister, Iwata et al., 2004;. Pfister, Bonislawski et al., 2006;. Pfister, Iwata et al., 2006;. Smith 2009). Dit is in dramatisch contrast met de regeneratieve groei conus extensie (in afwezigheid van mechanische stimuli), waar de gemiddelde groeipercentages 1mm/day met succesvolle regeneratie beperkt tot een lengte van minder dan 3 cm (Fu en Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al. 2011). Dienovereenkomstig, kan nader onderzoek van ASG helpen om ontregelde groei van mechanismen die vernieuwing te beperken bij het ontbreken van mechanische stimuli te onthullen.

Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Een unieke tissue engineering methode werd ontwikkeld om een ​​groot aantal zenuwvezels in de cultuur langwerpig door indient axon stretch groei, een vorm van het zenuwstelsel waarbij de groei van zenuwen langwerpig in combinatie met een groei van de zich uitbreidende lichaam.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Ontwerpen van poreuze Silicon Films als dragers van de zenuw groeifactor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...