Name: axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00
Duration: 11 min 46 s
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Este trabajo fue financiado por la NSF CARRERA CBET-0747615. Los autores desean agradecer a los Dres. Douglas H. Smith y David F. Meaney por su tutoría y apoyo.

1. Panorámica del sistema de estiramiento Axón biorreactor de crecimiento <ol><li> Dos enfoques predominantes han sido utilizados para aplicar fuerzas en los experimentos a las neuronas. En el primer enfoque, las fuerzas se aplican a toda la neurona (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). En el segundo enfoque, las fuerzas se aplican directamente sobre el axón tirando del cono de crecimiento. El uso de agujas de cristal, este último enfoque ha sido utilizado para la formación de los nuevos modelos axón (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), para identificar los umbrales de la fuerza para la elongación y retracción (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al, 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), y analizar la agrupación de neurotransmisores en terminales de los axones (Siechen, Yang et al 2009).. Una extensión de la ingeniería de tejidos únicos de este método fue desarrollado para producir grandes estructuras nerviosas con un crecimiento de los axones estiramiento automático (ASG) sistema de biorreactor (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recientemente, hemos desarrollado una versión en miniatura del sistema de biorreactor para estudiar microscópicamente ASG en tiempo real (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aquí, le detallamos el protocolo de 9 días (tabla 1) que actualmente utilizamos para preparar y llevar a cabo ASG biorreactores de forma rutinaria. </li><li> Operación general: El sistema de biorreactor de ASG se compone de tres componentes principales: 1) una cámara de biorreactor con carriles independientes (alargada pozos) donde las neuronas se cultivan y se estiró, 2) una mesa automatizada de movimiento lineal para aplicar las fuerzas de estiramiento y 3) un motor paso a paso Controlador de unidad con el software para controlar el crecimiento tramo (figura 1). </li><li> En pocas palabras, la fabricación de prototipos de reactor biológico se llevó a cabo en un taller mecánico con una fresadora vertical (Bridgeport, Elmira, Nueva York). Para la biocompatibilidad, la facilidad de la esterilización y la durabilidad, los componentes internos de reactor biológico fueron mecanizadas a partir de 3 / 8 &quot;polieteretercetona (PEEK). Transparente de policarbonato se utiliza para las tapas para permitir la microscopía de luz y de visión de las culturas. Resistentes a la corrosión 316 tornillos de acero inoxidable y hardware completa la asamblea (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> La cámara de biorreactor se compone de un marco de estiramiento que se forma 3 carriles, un bloque de remolque ajustable que manipula las células a través de los carriles, y que sobresalen las barras de remolque de la manipulación externa (figura 2). Cultivos neuronales son sembradas en los sustratos disponibles Aclar cultura remolque apoyado por el bloque de remolque (figuras 2 y 3). Un sustrato cubreobjetos estacionaria desechables se adhiere a la parte inferior del marco se extiende y abarca todos los 3 carriles. Antes de estiramiento, las neuronas plateado se debe extender axones del sustrato de remolque en el sustrato fija a través de la extensión cono de crecimiento. La población de los axones que unen los sustratos se sometan posteriormente se extienden por el desplazamiento del bloque de control de tracción. </li><li> La mesa automatizada de movimiento lineal se compone de un motor paso a paso (HT23-397, Applied Productos Motion, Watsonville, CA) y la tabla de movimiento lineal (MIPS-2-10-1.0mm, servosistemas, Monteville, NJ) montado en una tabla de alineación delrin . La cámara de bioreactor está sentado en la mesa paralela a la mesa de movimiento lineal. Las barras de remolque que se extiende desde la cámara de biorreactor se sujetan a la mesa de un movimiento lineal utilizando un adaptador. </li><li> El paso del motor variador de velocidad (Si el año 2035, productos aplicados en movimiento) se programa mediante el software incluido Si el programador para controlar la manipulación de los soportes de remolque. Tramo axonal se aplica en forma escalonada mediante la adopción de una serie de pasos pequeños desplazamientos separados por tiempos de espera (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Este sistema controlado por computadora ofrece la posibilidad de programar perfiles personalizados para ASG, y es esencial para la experimentación continua durante varios días a la semana. </li></ol> 2. Preparación de biorreactor de Cámara <ol><li> Preparar los sustratos cultura desechable de remolque y fijas para el cultivo neuronal: <ol><li> Sustratos de la cultura de remolque se cortan de 8.5 &quot;x 11&quot; hojas de película de Aclar (33C 2.0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Usando un cuchillo afilado corte de los sustratos de aproximadamente 0,5 x 2,5 cm, o un poco más corto que el ancho de los carriles para permitir al menos de 1-2mm espacio libre en ambos lados. </li><li> Lije ligeramente la parte inferior 1 / 3 de los sustratos de la cultura de remolque en ambos lados con buen papel de lija de 1200 (McMaster Carr). Lijado de los sustratos de arrastre facilita el crecimiento de los axones de los sustratos de remolque en el sustrato cubreobjetos estacionaria. </li><li> Corte de 5 x 7 cm pedazo de Aclar o utilizar un N º 1 cubreobjetos para servir como sustrato fijo (# 4.865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> ª limpiasustratos e la cultura con una solución diluida de Alconox y aclare con abundante purificada dH 2 O. </li><li> Esterilizar los sustratos de cultivo por inmersión en etanol al 70% durante 30 minutos. Deje que el sustrato se seque al aire dentro de una campana de cultivo de tejido estéril. </li></ol></li><li> Limpie la cámara de biorreactor con diluir Alconox y esterilizar en autoclave dentro de un contenedor de autoclave. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, para la transferencia de una campana estéril y dejar secar al aire. </li><li> Continuando dentro de la campana estéril de cola, los sustratos de cultivo para el biorreactor con silicona RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) y algodón estéril hisopos (McMaster Carr): <ol><li> Con las patas de bloques de remolque en su posición vertical completa, la cola de los sustratos cultura de remolque a las piernas de bloques de remolque en la parte sin arena. Evite el contacto con la superficie de cultivo con arena. </li><li> Pegue el sustrato de cultivo estacionario en la parte inferior de la cámara del biorreactor. </li><li> Retire el exceso de pegamento y bolsas de aire suavemente presionando un hisopo seco contra los sustratos pegados. </li><li> Desde silicona RTV ácido acético que se filtra es tóxico para las neuronas, el biorreactor se deja secar bajo luz UV dentro de la campana de 2 días completos antes de la introducción de cultivos neuronales. </li></ol></li><li> Baje las piernas bloque de remolque para lograr un traslape de 2-3mm entre las puntas de los sustratos de arena de remolque y el sustrato fijo. Atención fundamental debe ser pagado con el tamaño de la superposición, si es demasiado grande, las puntas de los sustratos de remolque puede desviar fuera del sustrato fijo, reduciendo el número de axones que se extienden la superposición (figura 3). </li><li> La posición del bloque de remolque en la posición inicial, con las barras de remolque se retractó en el interior del biorreactor. Apriete los tornillos de inmovilización para impedir el movimiento de las barras de remolque antes de estirar el crecimiento. </li></ol> 3. Cultivos neuronales <ol><li> 1 ml de la piscina de 10 mg / mL de alto peso molecular de poli-D-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) en el medio libre de suero en el área de interfase del sustrato de cada carril. Permita que la solución se adhieren en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague suavemente 3x con dH 2 O, seguido por un enjuague final con los medios de cultivo. Pipeteo debe realizarse en la parte posterior de los carriles, el más alejado de la interfaz de sustrato. </li><li> Aislar los explantes ganglios de la raíz dorsal (GRD) de una rata E16 cachorro. El uso de un microscopio estereoscópico, diluir los explantes en forma de gotas con placas de Petri. Recoger explantes 3-4 con una pipeta 100 L y la placa en el borde del sustrato de cultivo enarenado de remolque. Se debe tener cuidado a la placa de los explantes en el borde del soporte de remolque con un pequeño charco de los medios de comunicación. Hasta 1 ml de medio de cultivo por carril es suficiente para evitar la evaporación durante varias horas, al tiempo que limita el movimiento de los explantes. Formulación de los medios de comunicación: Neurobasal con B-27 + 0,5 mM L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de SFB-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L de D-glucosa (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/ml NGF (13.290-010, Invitrogen) y M 20 + 20 M FdU inhibidores de la mitosis uridina (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Coloque la tapa y la transferencia del biorreactor a una incubadora durante 1 hora o hasta que las células se adhieran. </li><li> Llenar el bioreactor con medios de cultivo en el punto más lejano de los explantes para evitar desalojo. Incubar el biorreactor de un mínimo de 5 días, mientras que las neuronas se extienden axones en el sustrato fijo. </li></ol> 4. El crecimiento del axón estiramiento <ol><li> El biorreactor se somete a los procedimientos de preparación final dentro de una campana estéril: <ol><li> Llenar los embalses en el biorreactor con tampón fosfato salino para humedecer la cámara de evaporación y límite de los medios de cultivo. En nuestro sistema, las paredes del recinto excavado servir como reservorios. Por otra parte, las pequeñas tapas de caja de Petri pueden ser colocados a cada lado del bloque de arrastre sobre los carriles de la cultura. </li><li> Vuelva a colocar los medios de cultivo y llenar las calles de su capacidad. Pipeteo debe realizarse en la parte posterior de los carriles, el más alejado de la interfaz de sustrato. </li></ol></li><li> El asiento del biorreactor dentro de la tabla de movimiento lineal automatizado. Si el experimento se va a ejecutar dentro de una incubadora, no debe ser humedecido debido a la corrosión potencial de la tabla de movimiento lineal automatizado. </li><li> Fije el adaptador de la barra de remolque a las barras de remolque. </li><li> Si el uso de software programador de correr la etapa de la tabla de movimiento lineal para alinearse con el adaptador de varilla de remolque y fijarlo en el escenario. Para mayor comodidad, preparar secuencias Si programador de antemano con el fin de manipular el escenario en incrementos específicos. </li><li> Afloje los tornillos de inmovilización en la cámara de biorreactor para permitir el movimiento libre del bloque de remolque. </li><li> Estiramiento se aplica en forma escalonada, iniciando una serie de pasos pequeños desplazamientos separados por tiempos de espera (Pfister, Iwata et al. 2006). Nuestro paradigma comienza tomando los pasos 2 m cada 172 segundos,resultando en una red de estiramiento de 1 mm en 24 horas. Después de un día, la velocidad de estiramiento puede ser aumentada mediante el aumento de los desplazamientos o la disminución del tiempo de permanencia (tabla 2). </li><li> Una vez que se inicia la ASG, los cambios en los medios de comunicación no suelen ser necesarios. Con el tiempo, sin embargo, la cultura en general, los medios de comunicación se vuelve ácida y se hace evidente por un cambio de color amarillento. Si se requiere una mayor experimentación, los viejos medios nunca se agote por completo, pero cambió de lugar sólo parcialmente con el fin de minimizar el trauma a los axones flotante. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Axones pueden experimentar un crecimiento tramo muy rápido y robusto. Inicialmente, el proceso se inicia con un período de estiramiento lento (≤ 1mm/day) que consiste en pequeños desplazamientos, poco frecuentes. Dentro de las primeras 24 horas de estiramiento, mecanotransducción de las vías de crecimiento neuronal se produce, según el cual las neuronas comienzan Además de los cilindros del axón. Dentro de las 24 horas de ASG continua, los axones muestran una mayor tolerancia a los desplazamientos mayores y más frecuentes. En general, los axones pueden soportar un aumento en la velocidad de estiramiento de 1mm/day cada 12-24 horas (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). El aumento de la velocidad de estiramiento antes de tiempo, sin embargo, puede conducir a un crecimiento más rápido de los axones de seleccionar, sino que también conducen a la oclusión patológica que causa la desconexión. Tramo de crecimiento axones tienen la tendencia a formar manojos, se asemeja a la arquitectura de los fascículos. La utilización de los protocolos actuales, la parte central, se extienden crecido de paquetes de axones no tienen adhesiones al sustrato de cultivo. Sólo el principio adherido, los segmentos proximal y distal de los axones se extienden de crecimiento permanecer unidos a los substratos de cultivo. En consecuencia, la parte central del tramo de los axones crecido flotar libremente, y son sensibles a las perturbaciones debidas a la manipulación. Por una variedad de razones, algunos axones no pueden crecer en la velocidad de estiramiento aplicado. Por ejemplo, una neurona DRG con dos axones, los cuales son sometidos a estiramiento, puede no ser capaz de traducir la suficiente proteína y hacer crecer a la velocidad de estiramiento aplicado. Los axones que no pueden acomodar el estiramiento aplicado delgada siguiente efecto de Poisson. Tramo posterior dará lugar a la oclusión de los axones, la inhibición de la Asamblea, lo que lleva a una desconexión patológica. La mayoría de los axones, sin embargo, son capaces de someterse a ASG con éxito y sólo un pequeño porcentaje de los axones se someten a este proceso de poda similar. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figura 1. Estiramiento Axon, el crecimiento del sistema de biorreactor. (A) biorreactor de cámara de cultivo y una mesa automatizada de movimiento lineal, (B) Paso del motor variador de velocidad y el software de programación Si. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figura 2. Cámara de Cultura del biorreactor. Esta caricatura muestra a la cámara de biorreactor de la parte superior con la tapa quitada. La posición del bloque de remolque refleja la etapa final del crecimiento de los axones se extienden. Estire los axones crecido se puede ver en paquetes dentro de los carriles de la cultura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figura 3. Sustrato de cultivo de interfaz de Revestimiento. Esta caricatura muestra los componentes del mecanismo de arrastre dentro de cada carril del biorreactor de vista lateral. (Arriba) superposición correcta de los sustratos de la cultura de remolque y parado. (Abajo) una duplicación excesiva de los sustratos de remolque y parado hace que la punta del soporte de remolque para rizar. Movie 1. Fijación de sustratos de cultivos de biorreactor de la Cámara. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> Movie 2. Revestimiento de DRG explantes sobre sustratos de remolque. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> Movie 3. Uso SiProgrammer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> Movie 4. Extensión cono de crecimiento sobre el sustrato fijo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> Película 5. Estirar el crecimiento axonal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Haga clic aquí para ver el video</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Día </td><td> Paso </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Esterilización y secado </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Encolado y la Asamblea </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Revestimientos y Revestimiento cultivo neuronal</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Tramo de inicio del crecimiento </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Experimento Lista. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> [Hr] </td><td> Velocidad de estiramiento [mm / día] </td><td> Tiempo de espera [s] </td><td> Longitud total [mm] </td><td> Time Stretch total [día] </td></tr><tr><td> Pretensión </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172.8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tramo </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172.8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Tramo </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86.4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Tramo </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57.6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tramo </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43.2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Tramo </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34.6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Estire Cuadro Tarifario. Todas las medidas se extienden de 2 micras en el desplazamiento (10 pasos motor paso a paso = 2 tramo micras).

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

El alargamiento mecánico ex vivo de células neuronales está patentado bajo las patentes de EE.UU. # 6264944 y # 7429267.

Dos pasos fundamentales deben ser observadas durante la preparación de los biorreactores. En primer lugar, una superposición óptima en la superficie del sustrato es necesario para asegurar que los axones pueden cruzar sobre el soporte fijo. Aclar que es excesivamente rizado o imperfecta de lo contrario no se debe utilizar (figura 3). Para optimizar la superposición, confirman que el sustrato de remolque es de arena de manera uniforme y en contacto con el sustrato fija de manera uniforme sobre una superficie de contacto de 2-3mm de largo. La coincidencia debe ser optimizado antes de cada experimento con cuidado de ajustar la altura de las piernas de remolque. En segundo lugar, mientras que proporciona para la conexión de las neuronas, las capas de sustrato mantener considerables fuerzas Sheering causada por el desplazamiento de la tensión de bioreactor y contráctiles de los axones (Heidemann y Buxbaum 1990, Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Sustratos se deben enjuagar bien con agua esterilizada antes y después del recubrimiento de lisina. Recubrimientos se debe aplicar a partir de alícuotas recién descongelado y difundir lo más uniformemente posible. Es importante destacar que los sustratos no debe ser movido o altera de cualquier otra durante el período de adhesión. En pasos posteriores, evitar el contacto con los sustratos en placas, y una pipeta todas las soluciones desde el otro extremo de las calles de distancia de la interfaz de sustrato. Tolerancias en las conexiones de cada componente biorreactor puede manifestarse en forma de relevo. Durante el período inicial de la ASG, holgura en el sistema es evidente que el movimiento de la tabla de movimiento lineal automático se produce sin el movimiento del bloque de remolque. Holgura puede variar según el experimento, pero es normalmente &lt;1 mm en nuestra experiencia. Por esta razón, una &quot;pre-tensión&quot; fase de eliminación de la holgura 1mm/day, por un día, precede a la ASG horario durante el cual las partes biorreactor participar y comenzar el movimiento de los sustratos de remolque. Solución de problemas puede ser necesaria si el paso de desplazamiento de la tabla de movimiento lineal automatizado no coincide con el desplazamiento del bloque de remolque después de la fase de pre-tensión se ha completado. Desplazamientos asíncrono, inexacta del bloque de remolque están asociados con &quot;fricción estática&quot; o fricción estática en el hardware de remolque y la flexión del adaptador. Para evitar estos problemas se produzcan, el movimiento del bloque de remolque debe ser revisado por la mano, después del montaje, de suave casi sin esfuerzo el movimiento. Si la vinculación se produce, el conjunto de remolque debe ser liberado antes de la experimentación. Suficiente rigidez del adaptador es necesario para asegurar los desplazamientos precisos, sincrónicos no son superados por la fricción estática de los equipos de remolque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del componente </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Poliéter (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Una medida que se biorreactor cámara </td></tr><tr><td> Policarbonato </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Una medida que se tapa la cámara de biorreactor </td></tr><tr><td> Motor paso a paso </td><td> Aplicada Productos Motion, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Tabla de movimiento lineal </td><td> Sistemas de Servo, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Paso motor variador de velocidad </td><td> Aplicada Productos Motion, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structure Probe Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Remolque cultura sustratos </td></tr><tr><td> N º 1 cubreobjetos </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Sustrato de cultivo estacionario </td></tr><tr><td> De silicona RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Con puntas de algodón </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Durante la pre-sináptica desarrollo embrionario, los procesos neuronales recorrer distancias cortas para alcanzar sus objetivos a través del cono de crecimiento. Con el tiempo, somata neuronal están separados de sus terminales de los axones, debido al crecimiento del esqueleto del organismo ampliación (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Este mecanotransducción induce un modo secundario de crecimiento neuronal capaz de acomodar el alargamiento continuo del axón (Bray 1984; Heidemann y Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al, 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. Crecimiento de los axones Stretch (ASG) es posiblemente un factor central en la maduración de los procesos a corto embrionarias en los nervios de largo y tractos de sustancia blanca característica del sistema nervioso adulto. Para el estudio de ASG in vitro, la ingeniería biorreactores para aplicar tensión a los procesos a corto axonal de cultivos neuronales (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aquí se detallan los métodos que usamos para preparar y llevar a cabo biorreactores ASG. En primer lugar, dentro de cada carril de estiramiento de los biorreactores, las neuronas se colocan sobre un sustrato de micro-manipulación de remolque. A continuación, las neuronas regenerar sus axones, a través de la extensión cono de crecimiento, en un sustrato fijo. Por último, el crecimiento de estiramiento se realiza remolcando el cuerpo celular plateado de los terminales de los axones adherido al sustrato fijo, recapitulando el crecimiento esquelético después de la extensión cono de crecimiento. El trabajo previo ha demostrado que la ASG de embriones de ratas las neuronas dorsales raíz de los ganglios son capaces de las tasas de crecimiento sin precedentes hasta 10mm/day, alcanzando una longitud de hasta 10 cm, mientras que al mismo tiempo que resulta en un aumento de diámetro axonal (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Esto está en marcado contraste con la extensión de regeneración cono de crecimiento (en ausencia de estímulos mecánicos), donde las tasas de crecimiento promedio 1mm/day con éxito la regeneración limitada a longitudes de menos de 3 cm (Fu y Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). En consecuencia, un mayor estudio de ASG puede ayudar a revelar los mecanismos de desregulación de crecimiento que limitan la regeneración en la ausencia de estímulos mecánicos.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Un método de ingeniería de tejidos único fue desarrollado para alargar las fibras nerviosas en numerosos cultura con una recapitulación de crecimiento de los axones se extienden, una forma de crecimiento del sistema nervioso por el que los nervios se alargan en conjunto con el crecimiento del cuerpo aumentando.

El crecimiento del axón Tramo: El Mecanotransducción de crecimiento neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntesis de oro Nanostar con un método de la Simiente de Plata crecimiento mediada por

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Investigación

Bioingeniería

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Diseño de películas de silicio poroso como portadores de Factor de crecimiento nervioso

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...