Name: axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av NSF KARRIÄR CBET-0.747.615. Författarna vill tacka Dr. Douglas H. Smith och David F. Meaney för sitt mentorskap och stöd.

1. Översikt av Axon Stretch Tillväxt Bioreaktor System <ol><li> Två dominerande metoder har använts för att tillämpa experimentella styrkor till nervceller. I den första metoden, finns krafter tillämpas på hela neuron (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010,.. Lindqvist, Liu et al 2010). I den andra metoden, finns krafter appliceras direkt på axonet genom att dra på tillväxten konen. Använda glas nålar, har den senare metoden använts för att modellera nybildning av axonet (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), för att identifiera tvinga tröskelvärden för töjning och upprullning (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), samt att analysera neurotransmittorn klustring i axonet terminaler (Siechen, Yang et al 2009.). En unik tissue engineering förlängning av denna metod har utvecklats för att producera stora nerv konstruerar med hjälp av ett automatiserat Tillväxt Axon Stretch (ASG) bioreaktor system (Iwata, Browne et al 2006,.. Pfister, Iwata et al 2006). Nyligen utvecklade vi en miniatyr av det bioreaktor systemet att studera ASG mikroskopiskt i realtid (Loverde, Ozoka et al. 2011). Här har vi detalj 9-dagars protokoll (tabell 1) vi använder idag för att förbereda bioreaktorer och utföra ASG rutinmässigt. </li><li> Övergripande Operation: Det ASG bioreaktor Systemet består av tre huvudkomponenter, 1) en bioreaktor kammare med oberoende körfält (avlånga brunnar) där nervceller odlade och sträcks, 2) en automatiserad linjär rörelse tabellen att tillämpa stretching krafter och 3) en stegmotor enhetsstyrkort med programvara för att styra sträcka tillväxt (figur 1). </li><li> Kortfattat var tillverkning av bioreaktor prototyper som utförs i en verkstad med hjälp av en vertikal fräsmaskin (Bridgeport, Elmira, NY). För biokompatibilitet, enkel sterilisering och hållbarhet, var de interna bioreaktor komponenterna svarvade ur 3 / 8 &quot;polyetereterketon (PEEK). Användes för lock för att möjliggöra ljusmikroskopi och visning av kulturer Transparent polykarbonat. Korrosionsbeständig 316 rostfria skruvar och beslag komplett församlingen (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Den bioreaktor kammare består av en stretching ram som bildar tre körfält, ett justerbart bogsering block som manipulerar celler inom hela gränder och utskjutande bogsering stavar för extern manipulation (figur 2). Neuronal kulturer är klädd på disponibel Aclar bogsering kultur substrat stöds av bogsering blocket (siffrorna 2 &amp; 3). En disponibel täckglas stationär substrat fäster botten av stretching ramen och spänner över alla tre körfält. Innan stretching, måste pläterade nervceller sträcka axonal processer från bogsering underlaget på den stationära substratet via tillväxt kotte förlängning. Befolkningen i axoner att överbrygga substrat därefter kommer att genomgå sträcka genom att kontrollera förskjutning av bogsering blocket. </li><li> Den automatiserade linjära rörelser tabell består av en stegmotor (HT23-397, Tillämpad Motion Products, Watsonville, CA) och linjära rörelser bord (MIPS-2-10-1.0mm, Servo System, Monteville, NJ) monterad på en delrin anpassning bord . Den bioreaktor kammaren sitter i tabellen parallellt med linjär rörelse bordet. Den bogsering stavar som sträcker sig från bioreaktor kammaren fästs i linjär rörelse tabellen med hjälp av en adapter. </li><li> Steget motordrift controller (Si 2035, Tillämpad Motion Products) programmeras med den medföljande Si programmerare programvara för att styra manipulation av bogsering substrat. Axonal sträcka tillämpas på ett stegvis genom att ta en serie små förskjutning steg fördelade med uppehållstid (Pfister, Iwata et al 2004,.. Pfister, Iwata et al 2006). Det datorstyrda systemet ger möjlighet att programmera kundanpassade profiler för ASG, och är en förutsättning för kontinuerlig experiment under flera dagar till veckor. </li></ol> 2. Beredning av Bioreaktor avdelningen <ol><li> Förbered disponibla bogsering och stationära kultur substrat för neuronala kultur: <ol><li> Bogsering kultur substrat har skurits ut från 8,5 &quot;x 11&quot; ark Aclar film (33C 2,0 mil, Struktur Probe, West Chester, PA). Med hjälp av en vass kniv skära substrat till ca 0,5 x 2,5 cm, eller något kortare än bredden på körfält att minst 1-2mm clearance på båda sidor. </li><li> Slipa försiktigt lägre 1 / 3: e för bogsering kultur substraten på båda sidor med fina 1200-slippapper (McMaster Carr). Slipning av bogsering substrat underlättar tillväxten av axoner från bogsering substrat på täckglaset stationära substrat. </li><li> Klipp ett 5 x 7cm bit Aclar eller använda en Nr 1 glas täckglas för att fungera som den stationära substrat (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> Rengör the kultur-substrat med en utspädd Alconox lösning och skölj noggrant med renat dH 2 O. </li><li> Sterilisera kulturen substrat genom nedsänkning i 70% etanol i 30 minuter. Låt substrat lufttorka i ett sterilt kultur huva. </li></ol></li><li> Rengör bioreaktor kammaren med utspädd Alconox och autoklavera sterilisera i en autoklav behållare. Omedelbart efter autoklavering, överföring till en steril huva och låt lufttorka. </li><li> Fortsätter i den sterila huven, limma den kultur substrat till bioreaktor med Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) och sterila bomull tippas kloak (McMaster Carr): <ol><li> Med bogsering blocket benen i sin fulla upprätt läge, limma bogsering kulturen substrat till bogsering blocket benen på den icke-slipas del. Undvik kontakt med slipade kulturen ytan. </li><li> Limma fast kulturen substrat till botten av bioreaktor kammaren. </li><li> Ta bort överflödigt lim och luftfickor genom att försiktigt trycka en torr kompress mot den limmade substrat. </li><li> Eftersom silikon RTV läcker ättiksyra som är giftigt för nervceller är bioreaktor lämnas att torka under UV-ljus i huven för 2 hela dagar före införandet av neuronala kulturer. </li></ol></li><li> Sänk bogsering blocket benen för att uppnå en 2-3mm överlappning mellan de tips av den slipade bogsering substrat och den stationära substrat. Avgörande uppmärksamhet måste ägnas till storleken på överlappningen, om det är för stor, kan tips om bogsering substrat avleda från den stationära substratet, minska antalet axoner som spänner över överlappning (figur 3). </li><li> Placera bogsering blocket vid startpositionen med bogsering stavar tillbaka inne i bioreaktor. Dra åt immobilisering skruvarna för att förhindra förflyttning av bogsering stavar innan sträcka tillväxt. </li></ol> 3. Neuronal kulturer <ol><li> Pool 1 mL 10 mikrogram / ml hög molekylvikt poly-D-lysin (katt # 354.210, BD, Bedford, MA) i serum-fri media på underlaget gränssnittet området i varje körfält. Låt lösningen att ansluta sig ostört under 1 timme i rumstemperatur. Skölj försiktigt 3x med dH 2 O, följt av en slutsköljning med kultur media. Pipettering bör göras på baksidan av banorna, längst underlaget gränssnittet. </li><li> Isolera Dorsal explants rotganglier (DRG) från en E16 hos råttungar. Använda ett stereomikroskop, späd explants i droppar med petriskålar. Samla 3-4 explants med 100 mikroliter pipett och plåt på kanten av slipade bogsering kulturen substrat. Försiktighet måste vidtas för att platta till explants vid kanten av bogsering substrat med en liten pöl av media. Upp till 1 mL odlingssubstrat per körfält är tillräckligt för att förhindra avdunstning i flera timmar och samtidigt begränsa rörelse explants. Media formulering: Neurobasal med B-27 + 0,5 mm L-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 G / L D-glukos (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF 13.290-010 (, Invitrogen) och 20 mikroM FDU + 20 mikroM uridin mitotiska hämmare (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Sätt på locket och föra över bioreaktor till en inkubator för 1 timme eller tills celler följa. </li><li> Fyll bioreaktor med odlingsmedia vid den punkt längst bort i explants att undvika dislodgment. Inkubera bioreaktor i minst 5 dagar medan nervceller förlänga axonal processer på fasta substrat. </li></ol> 4. Axon Stretch Tillväxt <ol><li> Den bioreaktor genomgår slutliga beredningen förfaranden inuti en steril huva: <ol><li> Fyll reservoarer inom bioreaktor med fosfatbuffrad koksaltlösning för att fukta kammaren och begränsa avdunstning av kultur media. I vårt system, urholkad höljet väggarna fungerar som reservoar. Alternativt kan små petriskål lock placeras på båda sidor om bogsering blocket på toppen av kulturen körfält. </li><li> Byt odlingsmedia och fyll körfält kapacitet. Pipettering bör göras på baksidan av banorna, längst underlaget gränssnittet. </li></ol></li><li> Seat bioreaktorn inom automatiserade linjär rörelse bord. Om experimentet är att köras i en inkubator, får det inte vara fuktas grund av risken för korrosion av den automatiserade linjär rörelse bord. </li><li> Fäst bogsering stången adaptern till bogsering stavar. </li><li> Använda Si programmerare programvara jogga i vilket skede av linjär rörelse bordet att anpassa sig till bogsering staven adaptern och fäst den på scenen. För enkelhetens skull förbereda Si Programmerare sekvenser i förväg för att manipulera scenen i specifika steg. </li><li> Lossa immobilisering skruvarna på bioreaktor kammaren för att fri rörlighet för bogsering blocket. </li><li> Stretch tillämpas på ett stegvis genom att inleda en serie små förskjutning steg fördelade med uppehållstid (Pfister, Iwata et al. 2006). Vår paradigm inleds med 2 ìm steg var 172 sekunder,resulterade i ett netto 1mm sträcker sig över 24 timmar. Efter en dag kan sträckan kurs som skall rampas genom att öka förskjutning eller minskar uppehållstiden (tabell 2). </li><li> När ASG initieras, är media förändringar vanligtvis inte nödvändig. Över tid, dock vänder kultur media i allmänhet sura och det är uppenbart av en gulaktig förändring i färg. Om ytterligare experimenterande krävs, gamla medier aldrig helt dränerade, utan endast delvis förändrats för att minimera skador till rörlig axoner. </li></ol> 5. Representativa resultat: Axonal processer kan genomgå en anmärkningsvärt snabb och robust stretch tillväxt. Inledningsvis börjar processen med en period av långsam stretching (≤ 1mm/day) som består av små, oregelbundna förskjutningar. Inom de första 24 timmarna av stretching, mechanotransduction av neuronala tillväxt vägar sker, där nervceller börjar Förutom axonet cylindern. Inom 24 timmars kontinuerlig ASG, axoner visa en större tolerans mot större och mer frekventa förskjutningar. I allmänhet kan axoner tåla en ökning av sträckan andelen 1mm/day var 12-24 timmar (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006,.. Pfister, Iwata et al 2006). Öka sträckan räntan för tidigt kan dock leda till en snabbare tillväxt av välja axoner men kommer också att leda till patologiska ocklusion som orsakar frånkoppling. Stretch växande axoner har en tendens att bilda buntar, som påminner om arkitekturen i fascicles. Med hjälp av dagens protokoll, den centrala, stretch vuxit del av Axon buntar har inga sammanväxningar till kulturen underlaget. Endast en början följs, proximal och distal delar av sträckan växande axoner kvar på den kulturen substrat. Därför den centrala delen av sträckan vuxit axoner sväva fritt, och är känsliga för störningar orsakade av hantering. Av olika skäl kan vissa axoner växer inte på den tillämpade sträck takt. Till exempel, en DRG neuron med två axonal processer, som båda genomgår stretch, kanske inte kan översätta tillräckligt med protein och växa i den tillämpade sträck takt. Axoner som inte kan ta emot de tillämpade sträckan kommer tunna följande Poissons effekt. Efterföljande sträcka kommer att leda till ocklusion av axoner, vilket hämmar montering, vilket leder till patologiska frånkoppling. Majoriteten av axoner, men har möjlighet att genomgå ASG framgångsrikt och endast en liten andel av axoner genomgå denna beskärning-liknande process. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figur 1. Axon Stretch Tillväxt Bioreaktor System. (A) Bioreaktor kultur kammare &amp; Automatiserad linjär rörelse bordet, (B) Steg motordrift controller och Si programmering programvara. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figur 2. Bioreaktor Kultur kammaren. Denna serie skildrar bioreaktor kammaren uppifrån med den borttagna lock. Placeringen av bogsering blocket speglar slutstadiet av Axon stretch tillväxt. Stretch vuxit axoner kan ses i buntar inom kulturen körfält. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figur 3. Kultur Substrat Plating Interface. Denna serie skildrar delar av bogsering mekanismen inom varje körfält i bioreaktor från sida vy. (Top) Korrekt överlappning för bogsering och stationära kultur substrat. (Längst ned) Överdriven överlappning för bogsering och stationära substrat orsakar toppen av bogsering substrat rullas ihop. Film 1. Attachment Kultur-substrat för att Bioreaktor avdelningen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Klicka här för att se på video</a> Film 2. Plätering av DRG explants på Bogsering substrat. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Klicka här för att se på video</a> Film 3. SiProgrammer Användning. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Klicka här för att se på video</a> Movie 4. Tillväxt Cone Förlängning på Stationära substrat. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Klicka här för att se på video</a> Movie 5. Axon Stretch tillväxt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Klicka här för att se på video</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Dag </td><td> Steg </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilisering &amp; Torkning </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Limning och montering </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Neuronal Kultur Plating</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Stretch Tillväxt Start </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Experiment schema. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tid [h] </td><td> Stretch Pris [mm / dygn] </td><td> Väntetid [s] </td><td> Total Längd [mm] </td><td> Totalt Stretch Tid [dagar] </td></tr><tr><td> Anspråk </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Stretch </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Stretch </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Stretch </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stretch </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Stretch </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Stretch Rate schema. Alla sträcka steg 2 nm i förskjutning (10 stegmotor steg = 2 ìm stretch).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration.">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li><li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth.">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li><li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions.">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li><li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon.">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li><li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces.">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li><li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+(Muller)+cells:+sensing+and+responding+to+tissue+stretch.">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li><li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons.">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , (2011).</li><li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair:+Surgical+Applications,+State+of+the+Art,+and+Future+Challenges.">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

Den ex vivo mekanisk töjning av neuronala celler är patenterat under US Patent # 6264944 och # 7.429.267.

Två viktiga steg bör observeras under beredningen av bioreaktorer. För det första är en optimal överlappning på substratet gränssnittet behövs för att axoner kan krysset till stationära underlaget. Aclar att alltför är böjt eller på annat sätt bristfälliga bör inte användas (figur 3). För att optimera överlappar varandra, bekräfta att bogsering underlaget slipas jämnt och kontakter den stationära substratet jämnt över en 2-3mm lång kontaktyta. Överlappningen bör optimeras innan varje experiment genom att noggrant justera höjden på bogsering benen. För det andra, samtidigt som för infästning av nervceller, substrat beläggningar upprätthålla betydande sheering krafter som orsakas av förskjutning av bioreaktor och kontraktila spänning axoner (Heidemann och Buxbaum 1990, Pfister, Iwata et al 2004,.. Loverde, Ozoka et al 2011). Underlaget bör sköljas noggrant med sterilt vatten både före och efter lysin beläggning. Beläggningar bör tillämpas från färska tinade alikvoter och spridas så jämnt som möjligt. Viktigt bör substrat inte flyttas eller på annat sätt störd under vidhäftning perioden. I efterföljande steg, undvika kontakt med substrat under plätering, och pipettera alla lösningar från bortre änden av gränderna bort från underlaget gränssnitt. Toleranser i anslutningarna av varje bioreaktor komponent kan manifesteras i form av slack. Under den inledande perioden av ASG är slack i systemet tydligt i rörelse av automatiserade linjär rörelse tabellen sker utan förflyttning av bogsering blocket. Slack kan variera per försök, men är normalt &lt;1mm i vår erfarenhet. Av denna anledning, en &quot;förspänning&quot; slack eliminationsfas av 1mm/day, för en dag, föregår ASG schemat under vilken bioreaktor delar engagera sig och börja rörelse bogsering substrat. Felsökning kan krävas om den förskjutning steg i automatiserade linjär rörelse tabellen inte stämmer med förskjutning av bogsering blocket efter förspänning fasen är klar. Asynkron, felaktig förskjutningar av bogsering blocket är förknippade med &quot;stiction&quot; eller statisk friktion i bogsering hårdvara och böja på adaptern. För att förhindra att dessa frågor uppstår, bör förflyttning av bogsering blocket kontrolleras för hand, efter montering, för smidig nästan utan ansträngning rörelse. Om bindande inträffar ska bogsering församlingen frigöras före experiment. Tillräcklig styvhet på adaptern är också nödvändigt att säkerställa korrekt, synkron förskjutningar är inte övervinnas genom stiction av bogsering hårdvara.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på komponent </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Polyetereterketon (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Skräddarsydda bioreaktor kammare </td></tr><tr><td> Polykarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Skräddarsydda bioreaktor kammare lock </td></tr><tr><td> Stegmotor </td><td> Tillämpad Motion Products, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Linjär rörelse bord </td><td> Servo System, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Steg motordrift styrenhet </td><td> Tillämpad Motion Products, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Struktur Probe Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Bogsering kultur substrat </td></tr><tr><td> Nr 1 täckglas </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Stationär kultur substrat </td></tr><tr><td> Silicon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Bomullspinne kompresser </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354.210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Under presynaptisk embryonal utveckling, neuronala processer passera korta sträckor för att nå sina mål genom tillväxt konen. Med tiden är neuronala somata skiljs från sina axon terminaler på grund skelettillväxt det växande organism (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Detta mechanotransduction inducerar ett sekundärt läge av neuronala tillväxt som kan ta emot kontinuerlig töjning av axonet (Bray 1984, Heidemann och Buxbaum 1994, Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004.). Axon Stretch Tillväxt (ASG) är möjligen en central faktor i mognaden av korta embryonala processer i det långa nerver och vit skrifter materia kännetecknande för den vuxna nervsystemet. Att studera ASG in vitro, konstruerade vi bioreaktorer att tillämpa spänning till den korta axonal processer neuronala kulturer (Loverde, Ozoka et al. 2011). Här detalj vi de metoder vi använder för att förbereda bioreaktorer och genomföra ASG. Först inom varje sträcka körfält i bioreaktor, är nervceller klädd på en mikro-manipulerad bogsering substrat. Därefter nervceller förnya sina axonal processer, via tillväxt kotte förlängning, på en stationär substrat. Slutligen är sträcka tillväxt utförs av bogsering av pläterade cellen organ från axonet terminalerna anslutit sig till stationära substratet, rekapitulera skelettillväxt efter tillväxt konen förlängning. Tidigare arbete har visat att ASG av embryonala råtta dorsala nervceller rotganglier klarar av aldrig tidigare skådad tillväxt fram till 10mm/day, nå längder på upp till 10 cm, medan samtidigt resulterar i ökad axonal diametrar (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Detta står i dramatisk kontrast till regenerativ tillväxt kotte förlängning (i avsaknad av mekaniska stimuli) där tillväxttakten i genomsnitt 1mm/day med framgångsrik förnyelse begränsad till längder på mindre än 3 cm (Fu och Gordon 1997,. Pfister, Gordon et al 2011). Därför kan ytterligare studier av ASG hjälpa till att avslöja oreglerad tillväxt mekanismer som begränsar förnyelse i avsaknad av mekaniska stimuli.

Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

En unik tissue engineering metod har utvecklats för att förlänga många nervtrådar i kulturen genom att rekapitulera tillväxt Axon stretch, en form av nervsystemet tillväxt där nerverna elongate i samband med en tillväxt på den växande kroppen.

Axon Stretch Tillväxt: Den Mechanotransduction av neuronala tillväxt

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Guld Nanostar Syntes med Silver Seed medierad tillväxthämning Metod

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Magnetic Resonance elastografi Metodik för utvärdering vävnadstekniska Construct tillväxt

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse fluorescensavbildning av Arabidopsis rottillväxt med Rapid Manipulering av Root miljö med hjälp av RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Framställning av hydroxi-PAAM Hydrogeler för Frikoppling av effekterna av mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electro tillväxtfaktor Släpper mikrosfärer i Fiber Ställningar

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Utforma porösa Silicon filmer som bärare av nervtillväxtfaktor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Tillväxt och karakterisering av bestrålade Organoider från bröst körtlar

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...