Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Het project werd ondersteund door de NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C. Wij danken Ming Chen voor zijn technische bijstand.

1. Programmeer de Amaxa 96 goed shuttle Nucleofector <ol><li> Open een nieuwe parameter bestand. </li><li> Selecteer het aantal putten zul je voor de standaard transfectie worden met behulp van door het slepen van de cursor over de 96 wells plaat diagram. Gebruik een minimum van drie waterputten tot het zwembad voor elke experimentele monster. </li><li> Voer de code-programma: in part1 selecteer &#39;FF&#39; en in part2 kies &#39;168 &#39;uit het pull-down menu&#39;s </li><li> Vanuit &#39;monocyt, menselijke&#39; Solu...

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

Efficiënte transfectie van naïeve primaire dendritische cellen is belangrijk voor de high throughput analyse en reverse engineering van cellulaire inflammatoire paden in deze sleutel cel bemiddelt het aangeboren-adaptieve immuun overgang. Echter, de meeste onderzoekers vinden dat deze cellen zijn moeilijk te efficiënt en zonder de transfectie procedure inducerende celrijping transfecteren wanneer er gebruik wordt standaard transfectie technieken. We hebben onderzocht of deze beperkingen kunnen worden overwonnen door ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Apparatuur / Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus # </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Volgnummer </td></tr><tr><td> Amaxa Human monocyt 96-well Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Bevat de Human monocyt 96-wells Nucleofector Solution, de 96-well Supplement en de Nucleocuvettes en platen </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Aangevuld met 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine naar DC groeimedium te maken </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> 3.070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Dendritische cellen </td><td> New York Blood centrum </td><td></td><td> DC&#39;s zijn gezuiverd van buffy coats met behulp van een standaard procedure </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Dendritische cellen (DC&#39;s) kan worden beschouwd als schildwachten van het immuunsysteem, die een cruciale rol spelen in de initiatie en reactie op de infectie 1. Detectie van pathogene antigen door naïeve DCs is door middel van patroonherkenning receptoren (PRRS), die in staat zijn om specifieke geconserveerd structuren aangeduid als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPS) te erkennen. Detectie van PAMPs door DCs triggers een intracellulaire signalisatie cascade resulteert in hun activering en transformatie om te rijpen DCs. Dit proces wordt doorgaans gekenmerkt door de productie van type 1 interferon samen met andere pro-inflammatoire cytokines, opregulatie van celoppervlaktemerkers zoals MHCII en CD86 en de migratie van de volwassen DC om drainerende lymfeklieren, waar de interactie met T-cellen initieert de adaptieve immuunrespons 2, 3. Zo, DC koppeling het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De mogelijkheid om de moleculaire netwerken die ten grondslag liggen DC naar aanleiding van de verschillende ziekteverwekkers ontleden is cruciaal voor een beter begrip van de regeling van deze signaalwegen en hun geïnduceerde genen. Het moet ook helpen de ontwikkeling van de DC-gebaseerde vaccins tegen infectieziekten en tumoren. Echter, deze lijn van onderzoek ernstig belemmerd door de moeilijkheid van het transfecteren primaire DCs 4. Virus transductie methoden, zoals het lentivirale-systeem, worden doorgaans gebruikt, maar dragen vele beperkingen, zoals de complexiteit en de bio-gevaarlijk risico (met de daaraan verbonden kosten) 5,6,7,8. Daarnaast is de levering van virale gen-producten verhoogt de immunogeniciteit van de getransduceerde DCs 9,10,11,12. Elektroporatie is gebruikt met gemengde resultaten 13,14,15, maar wij zijn de eersten die het gebruik van een high-throughput transfectie protocol rapport en overtuigend aan te tonen het nut. In dit rapport vatten we een optimale commerciële protocol voor high-throughput transfectie van menselijke primaire DCs, met een beperkte cel toxiciteit en een afwezigheid van DC rijping 16. Transfectie-efficiëntie (van GFP plasmide) en de levensvatbaarheid van de cellen werden meer dan 50% en 70% respectievelijk. FACS-analyse opgesteld van de afwezigheid van een toename van expressie van de rijping markers CD86 en MHCII in getransfecteerde cellen, terwijl qRT-PCR toonden geen opregulatie van IFNβ. Met behulp van deze elektroporatie protocol, we leveren het bewijs voor een succesvolle transfectie van DCs met siRNA en effectief naar beneden slaan van gerichte gen RIG-I, een belangrijke erkenning virale receptor 16,17, zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...