Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
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Das Projekt wurde vom NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C unterstützt. Wir danken Ming Chen für seine technische Unterstützung.

1. Programmieren Sie die Amaxa 96 well Shuttle Nucleofector <ol><li> Öffnen Sie eine neue Parameter-Datei. </li><li> Wählen Sie die Anzahl der Bohrlöcher Sie für Standard-Transfektion verwenden, indem Sie den Cursor über den 96-Well-Platte Diagramm wird. Verwenden Sie ein Minimum von 3 Brunnen zu bündeln für jede experimentelle Probe. </li><li> Geben Sie den Programm-Code: in part1 wählen &#39;FF&#39; und in part2 wählen &#39;168 &#39;aus dem Pulldown-Menüs </li><li> Von Solution Box wählen Sie &quot;Monozy...

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	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. 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Effiziente Transfektion von primären naiven dendritischen Zellen ist für hohen Durchsatz-Analyse und Reverse Engineering von zellulären Entzündungswege in diesem wichtigen Zell-Vermittlung der angeborenen-adaptive Immunsystem Übergang wichtig. Allerdings finden die meisten Forscher, dass diese Zellen nur schwer effizient und ohne die Transfektion induzieren Zellreifung transfizieren bei der Verwendung von Standard-Transfektion Techniken sind. Wir untersuchten, ob diese Einschränkungen, die im Hochdurchsatz-Protoko...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipment / Reagent </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Seriennummer </td></tr><tr><td> Amaxa menschlichen Monozyten 96-well Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Enthält der menschliche Monozyten 96-well Nucleofector Lösung, die 96-Well-Supplement und die Nucleocuvettes und Platten </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Ergänzt mit 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin zur DC Wachstumsmedium machen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> HyClone </td><td> 3070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Dendritische Zellen </td><td> New York Blood Center </td><td></td><td> DCs sind aus Buffy Coats mit einem Standard-Verfahren gereinigt </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems, die eine kritische Rolle bei der Einleitung und Reaktion auf eine Infektion 1 sein. Nachweis von pathogenen Antigen, das durch naive DCs wird durch pattern recognition receptors (PRR), die in der Lage, bestimmte konservierte Strukturen bezeichnet als pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) zu erkennen sind. Erkennung von PAMPs von DCs löst eine intrazelluläre Signalkaskade führt deren Aktivierung und Umwandlung zu reifen DCs. Dieser Prozess wird in der Regel durch die Produktion von Typ-1-Interferon gemeinsam mit anderen proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist, Hochregulation von Zelloberflächenmarker wie MHCII und CD86 und Migration der reifen DC zu drainierenden Lymphknoten, wo die Interaktion mit T-Zellen löst die adaptive Immunantwort 2, 3. So verlinken DCs der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Die Fähigkeit, die zugrunde liegenden molekularen Netzwerke DC Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger sezieren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Regulation dieser Signalwege und ihrer induzierten Gene. Es sollte auch dazu beitragen, die Entwicklung von DC-basierte Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Tumoren. Allerdings hat diese Linie der Forschung ist stark von der Schwierigkeit der Transfektion von primären DCS 4 behindert. Virus Transduktion Methoden, wie die lentiviralen Systems werden in der Regel verwendet, tragen aber viele Einschränkungen wie Komplexität und bio-Ex-Risiko (mit den damit verbundenen Kosten) 5,6,7,8. Darüber hinaus erhöht die Lieferung von viralen Genprodukte die Immunogenität dieser transduzierten DCs 9,10,11,12. Die Elektroporation wurde mit gemischten Ergebnissen 13,14,15 verwendet worden, aber wir sind die ersten, die Verwendung einer High-Throughput-Transfektionsprotokolls Bericht und schlüssig nachweisen seine Nützlichkeit. In diesem Bericht fassen wir ein optimiertes Protokoll für die kommerziellen High-Throughput-Transfektion von primären humanen DCs, mit begrenzten Zelltoxizität und das Fehlen von DC Reifung 16. Transfektionseffizienz (von GFP-Plasmid) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mehr als 50% bzw. 70%. FACS-Analyse wurde das Fehlen Erhöhung der Expression der Reifung Marker CD86 und MHCII in transfizierten Zellen, während qRT-PCR zeigte keine Hochregulation von IFNβ. Mit dieser Elektroporation Protokoll, bieten wir Beweise für eine erfolgreiche Transfektion von DCs mit siRNA und effektive knock down von gezielten Gen RIG-I, ein wichtiger viraler recognition receptor 16,17, sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...