Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
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Il progetto è stato sostenuto da NIH Contratto NIAID No. HHSN2662000500021C. Ringraziamo Ming Chen per la sua assistenza tecnica.

1. Programmare il Amaxa 96 pozzetti navetta Nucleofector <ol><li> Aprire un nuovo file di parametri. </li><li> Selezionare il numero di pozzi che verrà utilizzato per la trasfezione di serie trascinando il cursore sul diagramma 96 pozzetti. Usare un minimo di 3 pozzi di piscina per ogni campione sperimentale. </li><li> Inserire il codice del programma: in part1 selezionare &#39;FF&#39; e in part2 selezionare &#39;168 &#39;dal menu a discesa </li><li> Dalla soluzione casella di selezione &#39;Monocita, umano&#39; </li...

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	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. 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Trasfezione efficiente ingenuo cellule dendritiche primario è importante per l&#39;analisi di un elevato throughput e reverse engineering di cellulari vie infiammatorie in questa cellula fondamentale della mediazione innata-adaptive transizione del sistema immunitario. Tuttavia, la maggior investigatori scoprire che queste cellule sono di difficile trasfezione in modo efficiente e senza la maturazione di transfezione delle cellule procedura di induzione quando si utilizzano tecniche di trasfezione standard. Abbiamo stu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzature / Reagente </th><th> Azienda </th><th> Catalogo # </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-ben Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Numero di serie </td></tr><tr><td> Amaxa monociti umani a 96 pozzetti Kit Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Contiene i monociti umani a 96 pozzetti Soluzione Nucleofector, il supplemento a 96 pozzetti e la Nucleocuvettes e piastre </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Supplementato con 10% FCS, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina per rendere terreno di crescita continua </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td> Hyclone </td><td> 3.070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Le cellule dendritiche </td><td> New York Sangue centro </td><td></td><td> DC sono purificati da buffy coats utilizzando una procedura standard </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Le cellule dendritiche (DC) può essere considerato sentinelle del sistema immunitario che svolgono un ruolo critico nella sua iniziazione e la risposta alle infezioni 1. Rilevazione dell&#39;antigene patogeni da DC ingenuo è attraverso i recettori pattern recognition (PRR) che sono in grado di riconoscere specifiche strutture conservate denominate modelli molecolari patogeni associati (PAMPs). Rilevazione di PAMPs da DC innesca una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente loro attivazione e la trasformazione di DC mature. Questo processo è tipicamente caratterizzata da produzione di interferone di tipo 1 insieme ad altre citochine proinfiammatorie, sovraregolazione di marcatori cellulari di superficie come MHCII e CD86 e la migrazione delle DC mature ai linfonodi drenanti, dove l&#39;interazione con le cellule T avvia la risposta immunitaria adattativa 2, 3. Così, DC collegare i sistemi immunitario innato e adattativo. La capacità di sezionare le reti molecolari alla base della risposta DC a vari agenti patogeni è fondamentale per una migliore comprensione del regolamento di queste vie di segnalazione e le loro geni indotti. Dovrebbe anche contribuire a facilitare lo sviluppo di DC-based vaccini contro le malattie infettive e tumori. Tuttavia, questa linea di ricerca è stato gravemente ostacolato dalla difficoltà di trasfezione primario DC 4. Metodi di trasduzione del virus, come il sistema lentivirale, sono tipicamente utilizzati, ma portano molti limiti come la complessità e bio-pericolosi rischio (con i costi associati) 5,6,7,8. Inoltre, la consegna dei prodotti gene virale aumenta l&#39;immunogenicità di coloro trasdotte DC 9,10,11,12. Elettroporazione è stata utilizzata con risultati alterni 13,14,15, ma siamo i primi a segnalare l&#39;utilizzo di un high-throughput protocollo di trasfezione e definitivamente dimostrare la sua utilità. In questa relazione si riassumono un protocollo ottimizzato commerciale high-throughput per la transfezione di DC umane primarie, con limitata tossicità delle cellule e l&#39;assenza di maturazione DC 16. L&#39;efficienza di trasfezione (di plasmide GFP) e la vitalità delle cellule erano più del 50% e 70% rispettivamente. FACS analisi stabilito l&#39;assenza di aumento di espressione della maturazione e MHCII marker CD86 in cellule trasfettate, mentre qRT-PCR ha dimostrato di non sovraregolazione IFNβ. Usando questo protocollo di elettroporazione, forniamo le prove per la trasfezione di successo di DC con siRNA ed efficace di abbattere genica mirata RIG-I, un recettore chiave riconoscimento virale 16,17, sia a livelli di mRNA e proteine.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l&#39;infiammazione allergica delle vie aeree

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...