Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
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プロジェクトはNIH NIAID契約番号HHSN2662000500021Cによってサポートされていました。我々は彼の技術支援のために明陳に感謝。

1。プログラムAmaxa 96ウェルシャトルNucleofector <ol><li>新しいパラメータファイルを開きます。 </li><li>あなたが96ウェルプレートの図の上にカーソルをドラッグすることによって、標準的なトランスフェクションに使用する井戸の数を選択します。各実験サンプルのプールに3ウェルの最小値を使用してください。 </li><li>入力プログラムコード：その1 SELECT&#39;FF&#39;のがpart2のselect &#39;168&quot;プ?...

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. 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ナイーブな一次樹状細胞の効率的なトランスフェクションは、ハイスループット解析および自然免疫、獲得免疫の移行を仲介するこの重要な細胞内の細胞の炎症性経路のリバースエンジニアリングのために重要です。しかし、ほとんどの研究者はこれらの細胞は標準的なトランスフェクション技術を使用している場合の両方を効率的かつトランスフェクションの手順を誘導する細胞の成熟せ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>機器/試薬</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96ウェルシャトル</td><td>ロンザ</td><td> 108S0109 </td><td>シリアル番号</td></tr><tr><td> Amaxaヒト単球の96ウェルNucleofectorキット</td><td>ロンザ</td><td> VHPA - 2007 </td><td>ヒト単球96ウェルNucleofectorソリューション、96ウェルサプリメントとNucleocuvettesとプレートが含まれています</td></tr><tr><td> RIG - I siRNAを</td><td> Dharmacon </td><td> L - 012511〜00 </td><td></td></tr><tr><td> GLOのsiRNAを</td><td> Dharmacon </td><td> D - 001600 - 01から20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875 </td><td> DCの増殖培地を作るために10％FCS、2mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充した</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td> HyClone </td><td> 3070.03 </td><td></td></tr><tr><td>樹状細胞</td><td>ニューヨーク血液センター</td><td></td><td> DCは標準的な手順を使用して、バフィーコートから精製されています</td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

樹状細胞（DC）は、その開始及び感染1に応答において重要な役割を果たす免疫系の歩哨と見なすことができます。ナイーブなDCによる病原性抗原の検出は、病原体関連分子パターン（PAMPS）と呼ばれる特定の保存構造を認識することができるパターン認識受容体（PRRS）によるものです。 DCによるPAMPsの検出は、成熟樹状細胞への活性化と変革をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードをトリガします。このプロセスは通常、他の炎症性サイトカインと一緒に1型インターフェロンの産生によって特徴づけられる、そのようなT細胞との相互作用が適応免疫応答2を開始する所属リンパ節への成熟DCのMHCIIとCD86および移行などの細胞表面マーカーのアップレギュレーション、 3。従って、樹状細胞は自然免疫と獲得免疫系をリンク。 様々な病原体へのDC応答の根底にある分子ネットワークを解明する能力は、これらのシグナル伝達経路の調節とその誘導性遺伝子のより良い理解に重要です。また、感染症や腫瘍に対するDCベースのワクチンの開発を容易に役立つはずです。しかし、研究のこのラインは厳しく、プライマリDCは4をトランスフェクトすることの難しさによって妨害されています。 このようなレンチウイルスシステムなどのウイルスの伝達方法は、、一般的に使用されていますが、このような複雑さやバイオ危険なリスク（関連するコストと）5,6,7,8のような多くの制限を運ぶ。また、ウイルス遺伝子産物の配信は、DC 9,10,11,12を形質導入、それらの免疫原性を増加させる。エレクトロポレーションは、混合結果13,14,15と一緒に使用、しかし、我々はハイスループットトランスフェクションのプロトコルの使用を報告し、決定的にその有用性を実証する最初のですされています。 本報告書では、限られた細胞毒性およびDCの成熟16の不在で、人間の一次樹状細胞のハイスループットトランスフェクションに最適化された商用プロトコルをまとめたものです。トランスフェクション効率（プラスミドGFPの）と細胞の生存率はそれぞれ50％以上、70％であった。定量RT - PCRは、IFNβのない上方制御を実証しないままFACS分析は、トランスフェクションされた細胞の成熟マーカーCD86とMHCIIの発現の増加の有無を設立。このエレクトロポレーションプロトコルを使用して、我々はsiRNAと標的遺伝子RIG - I、mRNAとタンパク質レベルの両方で重要なウイルス認識受容体16,17、ノックダウン効果を持つ樹状細胞の正常なトランスフェクションのための証拠を提供する。

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

我々は、細胞の成熟を引き起こすことなく、プラスミドDNAやsiRNAのどちらかで初代ヒト単球由来樹状細胞をトランスフェクトの効率的な方法として私たちの最適化されたハイスループットnucleofectionのプロトコルを提示する。我々はさらなる標的遺伝子のmRNAとタンパク質レベルの両方におけるRIG - Iの成功のsiRNAサイレンシングのための証拠を提供する。

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em&gt;体外</em&gt;ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...