Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
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O projecto foi apoiado pelo NIH Contrato n º HHSN2662000500021C NIAID. Agradecemos Ming Chen por sua assistência técnica.

1. O programa Amaxa 96 poços Nucleofector shuttle <ol><li> Abra um arquivo novo parâmetro. </li><li> Selecione o número de poços que será utilizado para a transfecção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama de placa de 96 poços. Use um mínimo de três poços para piscina para cada amostra experimental. </li><li> Introduza o código do programa: em part1 selecionar &#39;FF&#39; e em part2 selecionar &#39;168 &#39;do pull down menus </li><li> De &#39;monócitos humanos, &quot;Solução caixa de seleção ...

<ol>
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Transfecção eficiente de células dendríticas naïve primário é importante para a análise de elevada capacidade e engenharia reversa de celulares vias inflamatórias nesta célula-chave mediando a transição inata-imune adaptativo. No entanto, a maioria dos investigadores acham que essas células são difíceis de transfecção tanto de forma eficiente e sem a maturação das células transfecção procedimento de indução ao usar técnicas de transfecção padrão. Nós investigamos se essas limitações poderi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento / Reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo # </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector de 96 poços Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Número de série </td></tr><tr><td> Amaxa Humanos monócitos de 96 poços Kit Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> VHPA de 2007 </td><td> Contém os monócitos humanos de 96 poços Solução Nucleofector, o Suplemento de 96 poços e as Nucleocuvettes e placas </td></tr><tr><td> RIG-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012.511-00 </td><td></td></tr><tr><td> SiRNA GLO </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Suplementado com 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml para fazer DC meio de crescimento </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> HyClone </td><td> 3.070,03 </td><td></td></tr><tr><td> As células dendríticas </td><td> New York Blood centro </td><td></td><td> DCs são purificados de casacos buffy usando um procedimento padrão </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

As células dendríticas (DCs) podem ser considerados sentinelas do sistema imune que desempenham um papel fundamental no seu início e resposta à infecção 1. Detecção de antígeno patogênicos por DCs naïve é através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que são capazes de reconhecer estruturas específicas conservadas referido como patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs). Detecção de PAMPs por DCs desencadeia uma cascata de sinalização intracelular, resultando em sua ativação e transformação para DCs maduras. Este processo é normalmente caracterizada pela produção de interferon tipo 1, juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, upregulation de marcadores da superfície celular como MHCII e CD86 e migração da DC maduro para os linfonodos de drenagem, onde a interação com as células T inicia a resposta imune adaptativa 2, 3. Assim, DCs ligação dos sistemas imune inata e adaptativa. A capacidade de dissecar as redes moleculares subjacentes DC resposta a vários patógenos é fundamental para uma melhor compreensão da regulação destas vias de sinalização e seus genes induzidos. Ele deve também ajudar a facilitar o desenvolvimento de DC baseado em vacinas contra doenças infecciosas e tumores. No entanto, esta linha de pesquisa tem sido severamente impedido pela dificuldade de transfecting DCs primários 4. Métodos de transdução de vírus, como o sistema lentiviral, são normalmente utilizados, mas carregam muitas limitações, como a complexidade e bio-perigosos risco (com os custos associados) 5,6,7,8. Além disso, a entrega de produtos do gene viral aumenta a imunogenicidade dos transduzidas DCs 9,10,11,12. Eletroporação tem sido usado com resultados mistos 13,14,15, mas somos os primeiros a relatar o uso de um protocolo de transfecção de alto rendimento e demonstrar conclusivamente a sua utilidade. Neste relatório, resumem um protocolo otimizado comercial para high-throughput transfecção de DCs humanas primárias, com limitada toxicidade celular e uma ausência de maturação DC 16. Eficiência de transfecção (GFP de plasmídeo) e viabilidade celular foram mais de 50% e 70%, respectivamente. FACS análise estabeleceu a ausência de aumento da expressão do CD86 e marcadores de maturação MHCII em células transfectadas, enquanto qRT-PCR não demonstrou upregulation de IFNβ. Usando este protocolo eletroporação, que fornecem evidências de sucesso da transfecção com siRNA DCs e eficaz knock down do gene alvo RIG-I, um receptor de reconhecimento chave viral 16,17, em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

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Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Imunologia e Infecção

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

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Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

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Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

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