Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Проект был поддержан NIH NIAID контракт № HHSN2662000500021C. Мы благодарим Мин Чена за его техническую помощь.

1. Программа Amaxa 96 и трансфер Nucleofector <ol><li> Откройте новый файл параметров. </li><li> Выберите количество скважин вы будете использовать для стандартных трансфекции, перемещая курсор на 96 лунок диаграмме пластины. Используйте не менее 3 скважин бассейн для каждого экспериментального образц?...

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

Эффективность трансфекции наивно первичных дендритных клеток имеет важное значение для высокой пропускной способности и анализа инженерный клеточных воспалительных путей в этой ключевой ячейки посредническую врожденной-адаптивной иммунной перехода. Тем не менее, большинство иссл?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Оборудование / реагент </th><th> Компания </th><th> Catalogue # </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-луночного Трансфер </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Серийный номер </td></tr><tr><td> Amaxa человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Содержит человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector Solution, 96-а дополнения и Nucleocuvettes и плит </td></tr><tr><td> RIG-I миРНК </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO миРНК </td><td> Dharmacon </td><td> Д-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> С добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, чтобы сделать DC ростовой среде </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-глютамин </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллин / стрептомицин </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Фетальной телячьей сыворотки </td><td> Hyclone </td><td> 3070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Дендритные клетки </td><td> Нью-Йорк Центр крови </td><td></td><td> РС очищают от слоя кровяного сгустка использованием стандартной процедуры </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Дендритные клетки (ДК) можно рассматривать часовых иммунной системы, которые играют важнейшую роль в его возбуждении и реакции на инфекцию 1. Обнаружение патогенных антигена наивно домена через распознавания образов рецепторы (РРСС), которые способны распознавать определенные сохраняющиеся структуры называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPS). Обнаружение PAMPs по РС вызывает внутриклеточный сигнальный каскад в результате чего их активации и перехода к зрелой DC. Этот процесс, как правило, характеризуется производство интерферона типа 1, наряду с другими провоспалительных цитокинов, регуляция клеточных поверхностных маркеров, таких как MHCII и CD86 и миграцию зрелых постоянного тока для слива лимфатические узлы, где взаимодействие с Т-клетки, инициирует адаптивного иммунного ответа 2, 3. Таким образом, контроллеры домена ссылку врожденной и адаптивной иммунной системы. Способность анализировать молекулярные сети постоянного тока основной ответ на различные патогенные имеет решающее значение для лучшего понимания регулирование этих сигнальных путей и их индуцированных генов. Он также должен способствовать развитию округ Колумбия, вакцин против инфекционных заболеваний и опухолей. Тем не менее, это направление было сильно мешают трудности трансфекции первичных контроллерах домена 4. Вирус трансдукции методы, такие как лентивирусов системы, как правило, используются, но имеют много ограничений, таких как сложность и биологически опасных рисков (с соответствующими затратами) 5,6,7,8. Кроме того, доставка продуктов вирусного гена увеличивает иммуногенность тех трансдуцированных домена 9,10,11,12. Электропорация была использована со смешанными результатами 13,14,15, но мы первыми сообщили использование высокой пропускной трансфекции протокол и убедительно доказать свою полезность. В этом докладе мы суммируем оптимизированных коммерческих протокол для высокой пропускной трансфекции первичных человеческих DC, с ограниченным токсичности клеток и отсутствие постоянного созревания 16. Трансфекция эффективности (GFP из плазмиды) и жизнеспособности клеток были более чем на 50% и 70% соответственно. FACS анализ установленных отсутствие увеличения выражение созревание маркеров CD86 и MHCII в трансфекции клеток, а QRT-PCR, не выявили регуляция IFNβ. Используя этот протокол электропорации, мы предоставляем доказательства для успешной трансфекции миРНК с контроллерами домена и эффективной сбить целевой ген RIG-I, ключевых вирусных рецепторов признание 16,17, как на РНК и белка.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Мы представляем наш оптимизированный для высокой пропускной nucleofection протокол как эффективный способ трансфекции первичных человеческих моноцитарных дендритные клетки либо с плазмидой ДНК или миРНК, не вызывая клетка созревания. Мы также предоставить доказательства для успешного глушителей миРНК целевой ген RIG-I как на РНК и белка.

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Анализ легких созревание дендритных клеток и миграции в течение аллергического воспаления дыхательных путей

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Подготовка опухолевый антиген нагруженных Зрелые дендритные клетки иммунотерапии

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Поколение незрелые, зрелые и толерогенную дендритных клеток с отличающимися метаболический фенотипов

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Новый протокол для генерации физиологических иммуногенных дендритных клеток

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Одноклеточный метод скрининга для отбора и восстановления антител с желаемой спецификой от обогащенной человеческой памяти B Популяции клеток

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...