Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Projektet fick stöd av NIH NIAID Kontrakt nr HHSN2662000500021C. Vi tackar Ming Chen för hans tekniskt bistånd.

1. Programmera Amaxa 96 bra transfer Nucleofector <ol><li> Öppna en ny parameter fil. </li><li> Välj antal brunnar du kommer att använda för vanliga transfektion genom att dra markören över 96 brunnar diagram. Använd minst tre brunnar till poolen för varje experimentell prov. </li><li> Ingång programkoden: i part1 välja &quot;FF&quot; och i part2 välj &#39;168 &#39;från rullgardinsmenyer </li><li> Från Lösning rutan välj monocyter, mänskliga &quot; </li><li> Under kontroll som tillval välja &quot;stan...

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

Effektiv transfektion av naiva primära dendritiska celler är viktig för hög genomströmning analys och reverse engineering av cellulära inflammatoriska vägar i denna nyckel cellen förmedla det medfödda-adaptiva immunförsvaret övergången. De flesta utredarna tycker att dessa celler är svåra att transfektera både effektivt och utan det transfektion förfarande förmå cellmognaden när man använder vanliga transfektion tekniker. Vi undersökte om dessa begränsningar kan övervinnas genom hög kapacitet pro...

<table border="1"><tbody><tr><th> Utrustning / reagens </th><th> Företag </th><th> Catalogue # </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-bra Shuttle </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Serienummer </td></tr><tr><td> Amaxa mänskliga monocyte 96-bra Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> Innehåller den mänskliga monocyte 96-bra Nucleofector lösning, 96-brunnars Tillägg och Nucleocuvettes och tallrikar </td></tr><tr><td> RIG-Jag siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012.511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11.875 </td><td> Kompletterat med 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mikrogram / ml streptomycin att göra DC odlingsmedium </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11.965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum </td><td> HyClone </td><td> 3070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Dendritiska celler </td><td> New York Blood centrum </td><td></td><td> Utvecklingsländerna är renade från buffy rockar med en vanlig procedur </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Dendritiska celler (DC) kan anses vara vaktposter av immunsystemet, som spelar en avgörande roll i initiering och svar på infektion 1. Upptäckt av patogena antigen genom naiv Utvecklingsländerna är via receptorer mönsterigenkänning (PRRS) som kan känna igen specifika bevarade strukturer som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPS). Upptäckt av PAMPs av utvecklingsländernas utlöser en intracellulär signalering kaskad resulterar i aktivering och omvandling till mogna utvecklingsländer. Denna process är normalt kännetecknas av produktion av typ 1-interferon tillsammans med andra proinflammatoriska cytokiner, uppreglering av markörer på cellytan som MHCII och CD86 och migration av den mogna DC till dränering lymfkörtlar, där interaktionen med T-celler initierar det adaptiva immunsvaret 2, 3. Således fick utvecklingsländer länk det medfödda och adaptiva immunsystem. Förmågan att dissekera den molekylära nätverk som ligger bakom DC svar på olika patogener är avgörande för en bättre förståelse av regleringen av dessa signalvägar och deras inducerade gener. Det bör också bidra till att underlätta utvecklingen av DC-baserade vacciner mot infektionssjukdomar och tumörer. Emellertid har denna forskningsinriktning allvarligt hindras av svårigheten att transfecting primära utvecklingsländernas 4. Virus transduktion metoder, såsom Lentiviral systemet används normalt, men bär många begränsningar, såsom komplexitet och biologiskt farliga risker (med tillhörande kostnader) 5,6,7,8. Dessutom ökar leveransen av gener produkter immunogeniciteten av dessa transduced utvecklingsländernas 9,10,11,12. Elektroporation har använts med blandat resultat 13,14,15, men vi är de första att rapportera användningen av en hög genomströmning transfektion protokollet och slutgiltigt visa sin nytta. I denna rapport sammanfattar vi en optimerad kommersiella protokoll för hög genomströmning transfektion av människans primära utvecklingsländerna, med begränsad celltoxicitet och avsaknad av DC mognad 16. Transfektion effektivitet (av GFP plasmid) och cellviabiliteten var mer än 50% respektive 70%. FACS analys etablerade avsaknad av ökningen uttryck för mognad markörerna CD86 och MHCII i transfekterade celler, medan QRT-PCR visade inga uppreglering av IFNβ. Med hjälp av denna elektroporation protokoll ger vi belägg för framgångsrik transfektion av DCS med siRNA och effektivt slå ner riktade gen RIG-I, en nyckel virus erkännande receptorn 16,17, både på mRNA-och proteinnivåer.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Vi presenterar våra optimerade hög genomströmning nucleofection protokoll som ett effektivt sätt att transfecting primära humana monocyt-härledda dendritiska celler med antingen plasmid DNA eller siRNA utan att orsaka cellmognaden. Vi ger ytterligare bevis för framgångsrik siRNA tysta riktade genen Rig-i på både mRNA-och proteinnivåer.

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analys av Pulmonell mognad av dendritiska celler och migration under Allergisk luftvägsinflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Framställning av tumörantigen-laddade mogna dendritceller för Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv och High Yield Metod för isolering av mus dendritiska cellundergrupper

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generation av omogna, mogna och tolerogena dendritiska celler med olika Metabolic fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utveckling och validering av en Ultrasensitive enda molekyl Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay för humant Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Nytt protokoll för generering av fysiologisk immunogena dendritiska celler

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Single-cell screening metod för urval och återhämtning av antikroppar med önskade särdrag från berikade Human minne B cellpopulationer

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...