Name: optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Proje NIH NIAID Sözleşme No HHSN2662000500021C tarafından desteklenmiştir. Ming Chen Biz onun teknik destek için teşekkür ederiz.

1. Programı Amaxa 96 servis Nucleofector <ol><li> Yeni bir parametre dosyasını açın. </li><li> 96 plaka şeması üzerine imleci sürükleyerek standart transfeksiyon için kullanıyor olacak kuyuların sayısını seçin. Havuza her bir deney numune için en az 3 kuyu kullanın. </li><li> Giriş program kodu: part1 seçin &#39;FF&#39; ve part2 seçin &#39;168 &#39;aşağı çekme menüler </li><li> Çözüm kutusunu seçin &#39;Monosit, insan&#39; </li><li> Kontrol Seçeneği altında &#39;Standart&#39; seçene?...

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

Verimli naif birincil dendritik hücrelerin transfeksiyon, yüksek verimlilik analizi ve, doğuştan gelen adaptif bağışıklık geçiş aracılık bu anahtar hücre, hücresel inflamatuar yollarının tersine mühendislik için önemlidir. Ancak, çoğu araştırmacı bu hücrelerin standart transfeksiyon teknikleri kullanarak hem verimli ve transfeksiyon prosedürü inducing hücre olgunlaşması olmadan transfect zor olduğunu bulabilirsiniz. Bu sınırlamalar, eş zamanlı, bağımsız bir 96-iyi ticari nükleer t...

<table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman / reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-iyi Servisi </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> Seri numarası </td></tr><tr><td> Amaxa İnsan Monosit 96-Nucleofector Kiti </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> İnsan monosit 96 Nucleofector Çözüm, 96-iyi Supplement ve Nucleocuvettes ve plakalar içerir </td></tr><tr><td> Rig-I siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012.511-00 </td><td></td></tr><tr><td> GLO siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> Ile desteklenmiş% 10 FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve DC besi yapmak için 100 mg / ml streptomisin </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu </td><td> HyClone </td><td> 3070,03 </td><td></td></tr><tr><td> Dendritik Hücreler </td><td> New York Kan merkezi </td><td></td><td> DC&#39;ler standart bir prosedür kullanılarak buffy kat arınmış. </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin başlatılması ve enfeksiyon 1 yanıt kritik bir rol oynayan nöbetçi olarak kabul edilebilir . Naif DC&#39;ler tarafından patojenik antijen tespiti, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) olarak adlandırılan özel korunmuş yapıları tanıyamaz örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) geçer. DC&#39;ler tarafından PAMPs Algılama olgun DC&#39;lere aktivasyon ve dönüşüm sonuçlanabilecek bir hücre içi sinyal basamaklarını tetikler. Bu süreç genellikle diğer proinflamatuar sitokinlerin birlikte, tip 1 interferon üretimi ile karakterize, olgun T hücreleri ile etkileşim adaptif immün yanıt 2 başlatır drenaj lenf düğümleri, DC MHCII ve CD86 ve göç gibi hücre yüzey belirteçlerinin upregülasyonunun 3. Bu nedenle, DC&#39;ler doğal ve adaptif bağışıklık sistemi bağlantısı. Çeşitli patojenler DC tepkisi altında yatan moleküler ağlar incelemek için yetenek bu sinyal yollarının düzenlenmesi ve kaynaklı genlerin daha iyi anlaşılması için çok önemli. Bu aynı zamanda bulaşıcı hastalıklar ve tümörlere karşı DC tabanlı aşılar gelişimi kolaylaştırmak için yardımcı olacaktır. Ancak, bu araştırma çizgi ciddi zorluk birincil DC&#39;ler 4 transfecting engellemiştir. Virus lentiviral sistemi olarak iletimi yöntemleri, tipik olarak kullanılır, ancak bu karmaşıklık ve biyo-tehlikeli bir risk (ilgili maliyetler) 5,6,7,8 gibi birçok sınırlamalar taşır. Ayrıca, viral gen ürünleri teslim DC&#39;ler 9,10,11,12 transduced immünojenite artar. Elektroporasyon karışık sonuçlar 13,14,15 ile kullanılan, ancak biz, yüksek verimli bir transfeksiyon protokol kullanım raporu ve kesin kendi programını göstermek için ilk olmuştur. Bu yazıda, sınırlı hücre toksisitesi ve DC olgunlaşma (16) yokluğu, insan birincil DC&#39;ler yüksek verim transfeksiyon için optimize edilmiş bir ticari protokol özetleyebiliriz . Transfeksiyon verimlilik (plazmid GFP) ve hücre canlılığı fazla sırasıyla% 50 ve% 70 idi. QRT-PCR IFNβ hiçbir upregülasyonu gösterdi FACS analizi, transfekte hücrelerde olgunlaşma belirteçlerinin CD86 ve MHCII ifade artış olmaması kurdu. Bu elektroporasyonu protokolü kullanarak, başarılı transfeksiyon DC&#39;ler siRNA ve etkili hedeflenen gen yıkmak için kanıt sağlamak Rig-I mRNA ve protein seviyeleri hem de kilit bir virüs tanıma reseptör 16,17,.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Fizyoloji Immunogenic dendritik hücreler oluşturma için yeni protokol

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...