Name: a protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2011-05-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

Författarna vill tacka John Frey och Ben Peterson för mygga uppfödning. Vi vill också tacka Christine Davis och Gary Radice för hjälp med hemocyte micrographs. Denna forskning har finansierats av University of Richmond Arts &amp; Science sommaren gemenskap till AA Qayum och fakultetsanslaget till A. Telang.

1. Preparat i förväg hemocyte samlingen <ol><li> Bered en lösning hemolymph spädningsvätska som består av 60% Schneiders Medium, 10% fetalt bovint serum (FBS), och 30% citratbuffert (antikoagulantia, 98 mm NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM citronsyra, pH 4,5) 11. Gör 1,0 mL alikvoter som kan lagras vid -20 ° C. Använd varje alikvot endast en gång (se material). </li><li> Förbered diabilder glas mikroskop (75 x 25 x 1 mm) genom att göra poäng en en cirkel cm i diameter i ena änden med hjäl...

<ol>
	<li>Enayati, A., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+management:+past,+present,+and+future.">Malaria management: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).</li><li>Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+transgenic+mosquitoes+on+dengue+virulence+to+humans+and+mosquitoes.">The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes.</a> The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).</li><li>Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+studies+on+the+innate+immunity+of+disease+vectors.">Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors.</a> Insect Sci. 15, 15-15 (2008).</li><li>Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midgut+basal+lamina+thickness+and+dengue-1+virus+dissemination+rates+in+laboratory+strains+of+Aedes+albopictus+(Diptera:+Culicidae).">Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).</li><li>Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+infection+responses+in+the+haemocytes+of+the+mosquito,+Aedes+aegypti.">Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).</li><li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+cellular+immune+response.">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15, 1-1 (2008).</li><li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+mortality+in+immune+challenged+mosquitoes+(Aedes+aegypti)+correlates+with+a+decrease+in+haemocyte+numbers.">Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers.</a> Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).</li><li>Chen, C. C., Laurence, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+on+humoral+encapsulation+of+microfilariae:+establishment+of+technique+and+description+of+reaction.">In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction.</a> International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).</li><li>Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dirofilaria+immitis:+effects+on+hemolymph+polypeptide+synthesis+in+Aedes+aegypti+during+melanotic+encapsulation+reactions+against+Microfilariae.">Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae.</a> Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).</li><li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+innate+immune+response+by+the+mosquito+Aedes+aegypti+is+mediated+by+hemocytes+and+independent+of+Gram+type+and+pathogenicity.">The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity.</a> Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).</li><li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).</li></ol>

Den hemocyte kollektionen här beskrivna metoden är modifierad från de tidigare publicerade metoder och gör att man kan isolera rena beredningar av hemocyter från Aedes myggor med färre steg. Medan våra särskilt intresse ligger i att karakterisera hemocyte populationer i Aedes myggor, tror vi denna teknik kan tillämpas på andra mygga grupper efter inledande försök utförs för att fastställa korrekt injektion volymer. Vår protokollet använder blodförtunnande buffertar i stället för sal...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> Schneiders Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0146 </td><td></td></tr><tr><td> Fostrets bovint serum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Hema3 fläcken kit </td><td> Fisher </td><td> 123-869 </td><td></td></tr><tr><td> Glas nålar (Borosilikatglas med glödlampa) </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78-10 </td><td> 1,0 OD och 0.78mm ID </td></tr><tr><td> Nål avdragare </td><td> Sutter Instrument </td><td> Modell P-87 </td><td></td></tr><tr><td> MicroInjector </td><td> Tritech Forskning </td><td> MINJ-PD </td><td></td></tr><tr><td> Nål </td><td> Tritech Forskning </td><td> MINJ-4 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito aedes aegypti

Myggor är vektorer för ett antal sjukdomsframkallande patogener som gula febern-virus, parasiter malaria och filarial maskar. Laboratorier utreder anti-patogen komponenter i det medfödda immunförsvaret i arter smittospridare i hopp om att generera transgena myggor som är refraktära mot sådana patogener 1, 2. Det medfödda immunförsvaret av myggor består av flera försvarslinjer 3. Patogener som lyckas fly den barriär som följer av epitel-fodrade myggor midgut 4 Ange hemolymph och möter cirkulerande hemocyter, viktiga cellulära komponenter som förankrar och uppsluka patogener 5, 6. Forskare har inte funnit bevis för hematopoetiska vävnader i myggor och aktuella uppgifter tyder på att antalet hemocyter har fastställts till vuxen uppkomst och siffror kan faktiskt minska i takt med mygga åldrarna 7. Förmågan att korrekt samla in och identifiera hemocyter från medicinskt viktiga insekter är ett viktigt steg för studier i cellulär immunitet. Men de små myggor och den begränsade volymen av hemolymph en utmaning att samla immunceller. Två etablerade metoder för insamling mygga hemocyter inkluderar utvisning av hemolymph från en klippa snabel 8, och volym förskjutning (perfusion), där saltlösning injiceras i membranös necklike regionen mellan huvudet och bröstkorgen (dvs cervix) och perfusion hemolymph samlas från ett sönderrivet öppning i en distal regionen av buken 9, 10. Dessa tekniker är dock begränsad av låga återvinning av hemocyter och eventuell förorening med fett kroppens celler, respektive 11. På senare tid har en metod kallad high förbättrad injektion / återhämtning återvinning av immunocytes genom användning av antikoagulantia buffertar samtidigt minska nivåerna av förorenande skalor och inre vävnader 11. Även denna metod möjliggör en förbättrad metod för att samla in och bevara hemocyter för primär kultur innebär det ett antal injektion och samla steg som inte är nödvändiga om det efterföljande målet är att samla in, fixa och bets hemocyter för diagnostik. Här visar vi vår metod för att samla in mygga hemolymph som kombinerar enkelhet perfusion, med hjälp av blodförtunnande buffertar i stället för saltlösning, med en noggrannhet av hög injektionsteknik att isolera rena beredningar av hemocyter i Aedes myggor.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

En förenklad ännu inte exakt metod för att samla in och färga mygga hemocyter beskrivs. Vår metod kombinerar enkelhet perfusionen med en noggrannhet av hög injektionsteknik att isolera rena beredningar av hemocyter i Aedes myggor. Denna metod underlättar studier som kräver kunskap om vilka typer av hemocyter och deras överflöd.

Ett protokoll för insamling och färgning hemocyter från gula febern Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

En Kalcium bioluminescence-analys för funktionsanalys av Mosquito ( Aedes aegypti) Och Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G proteinkopplade receptorer

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex protokoll för DNA-extraktion från<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes från Drosophila melanogaster larver för mikrobiell infektion och analys

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Co färgning blodkärl och nervtrådar i fettvävnad

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Förökning av Microsporidian Parasite Edhazardia aedis i Aedes aegypti Myggor

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Utfodring och kvantifiering av animaliskt härlett blod och konstgjorda måltider i Aedes aegypti myggor

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...