Name: activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS042197 MD. AJK נתמך על ידי מענקים T32GM008719 ו F30NS068006.

1. הפקה של מחטים Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מפוברק מחטים microinjection זמינים מסחרית (לדוגמה. Femtotips מ Eppendorf) ו שימושיים אם לא מבצע מספר רב של microinjections. עם זאת, עבור אלה שרוצים להקים לטווח ארוך יכולות microinjecting, אלטרנטיבה היא לייצר מחטים micr...

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+structures+that+shape+caspase+activity,+specificity,+activation+and+inhibition.">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cell+death:+outer+membrane+permeabilization+and+beyond.">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li><li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

Microinjection של ציטוכרום C ישירות לתוך הציטופלסמה של תאים הוא כלי ייחודי ורב עוצמה המאפשר ללימודי תקנה שלאחר המיטוכונדרי של אפופטוזיס. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת הפעלה ישירה של הזרם אפופטוזיס של המיטוכונדריה ללא שימוש בחומרים אשר גורמים נזק הסלולר או המיטוכונדריה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> DM IRE2 מיקרוסקופ הפוך </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 מחט Microinjection פולר </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קיר דק Boroscilicate נימי זכוכית עם Microfilament </td><td> AM מערכות </td><td> 615000 </td><td> 4 סנטימטר אורך, 1.00 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 0.75 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Rhodamine isothiocyanate B-dextran </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R9379 </td><td> משקל מולקולרי ממוצע ~ 70,000 Da </td></tr><tr><td> שור ציטוכרום חלבון ג </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

אפופטוזיס או מות תאים מתוכנת, הוא מסלול שימור פיקוח הדוק שבאמצעותם תאים מתים 1. אפופטוזיס יכול להיות מופעלות כאשר תאים המפגש מגוון רחב של מדגיש ציטוטוקסיות. עלבונות אלה ליזום מפלי איתות כי בסופו של דבר לגרום לשחרור ציטוכרום C מהחלל intermembrane המיטוכונדרי אל הציטופלסמה 2. שחרורו של ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה היא אירוע שמפעיל את מפתח ההפעלה המהירה של caspases, פרוטאזות הסלולר המפתח אשר בסופו של דבר לפועל מוות של תאים 3-4. מסלול של אפופטוזיס מוסדר בנקודות במורד הזרם של שחרור ציטוכרום C מתוך המיטוכונדריה 5. על מנת ללמוד את תקנה שלאחר המיטוכונדרי של הפעלת caspase, חוקרים רבים פנו microinjection cytoplasmic ישירה של holocytochrome ג (heme המצורפת) חלבונים לתוך התאים 6-9. ציטוכרום C הוא מקומי בדרך כלל המיטוכונדריה שם הקובץ המצורף של קבוצת heme הוא הכרחי כדי לאפשר לה להפעיל אפופטוזיס 10-11. לכן, כדי להפעיל ישירות caspases, יש צורך להזריק את החלבון holocytochrome ג במקום cDNA שלו, כי בעוד ביטוי של ציטוכרום C מתוך בונה cDNA תגרום המיקוד ואת המיטוכונדריה מצורף heme, זה יהיה מוחרם מ caspases cytosolic. לפיכך, microinjection cytosolic ישירה של חלבון מטוהרים heme המצורפת ג ציטוכרום הוא כלי שימושי לחקות לשחרר המיטוכונדריאלי ציטוכרום C ו אפופטוזיס ללא שימוש עלבונות רעילים אשר גורמים נזק הסלולר המיטוכונדריה. במאמר זה, אנו מתארים שיטה microinjection של החלבון ציטוכרום C לתוך התאים, באמצעות העכבר fibroblasts עובריים (MEFs) ו נוירונים אוהד העיקרי כדוגמאות. בעוד פרוטוקול זה מתמקד הזרקה של ג ציטוכרום לחקירות של אפופטוזיס, טכניקות המוצג כאן ניתן להתאים בקלות עבור microinjection של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את microinjection cytoplasmic ישירה של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; החלבונים לתוך fibroblasts ונוירונים אוהד העיקרי. טכניקה זו מאפשרת המבוא של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; החלבונים לתוך הציטופלסמה של תאים מחקה את שחרורו של ציטוכרום<em&gt; ג</em&gt; מן המיטוכונדריה, אשר מתרחשת במהלך אפופטוזיס.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

ראיון: Antigen Presentation Glycolipid ידי CD1d ואת הפוטנציאל הטיפולי של הפעלת התא NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

סינתזה של<em&gt; ב-vivo</em&gt;-MRI לגילוי אפופטוזיס בדיקה

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...