Name: activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder NS042197 a MD. AJK foi suportada por concessões T32GM008719 e F30NS068006.

1. Produção de agulhas microinjeção <ol><li> Agulhas pré-fabricados microinjeção estão disponíveis comercialmente (eg. Femtotips de Eppendorf) e são úteis se não se está realizando um grande número de microinjeções. No entanto, para aqueles que desejam estabelecer a longo prazo as capacidades para microinjecting, uma alternativa é produzir agulhas microinjeção no laboratório usando de parede fina de vidro de borosilicato capilares e um extrator de agulhas comerciais. Isso também permite q...

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	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. 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O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

A microinjeção de citocromo c diretamente no citoplasma das células é uma ferramenta original e poderosa que permite estudos de regulação pós-mitocondrial da apoptose. Importante, esta técnica permite a ativação direta da apoptose a jusante da mitocôndria sem o uso de agentes que causam dano celular ou mitocondrial. Embora este protocolo tem se concentrado em microinjeção de citocromo c para estudos sobre apoptose, os princípios gerais da microinjeção de pro...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> DM IRE2 microscópio invertido </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 Puller Needle microinjeção </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 micromanipulador </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microinjetor </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De parede fina de vidro Boroscilicate capilar com Microfilamentos </td><td> Sistemas de AM </td><td> 615000 </td><td> 4 Comprimento polegadas, 1,00 mm de diâmetro externo, 0,75 mm de diâmetro interno </td></tr><tr><td> Rodamina B isotiocianato-Dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> Peso molecular médio ~ 70000 Da </td></tr><tr><td> Citocromo c bovina Protein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

Apoptose, ou morte celular programada, é uma via conservada e altamente regulado pelo qual as células morrem 1. Apoptose pode ser desencadeada quando as células encontrar uma ampla gama de tensões citotóxicos. Estes insultos iniciar cascatas de sinalização que acaba por causar a liberação de citocromo c do espaço intermembranar mitocondrial para o citoplasma 2. A liberação de citocromo c da mitocôndria é um evento-chave que desencadeia a rápida ativação das caspases, as proteases celular chave que acaba por executar a morte celular 3-4. A via de apoptose é regulada em pontos a montante ea jusante da liberação do citocromo c da mitocôndria 5. A fim de estudar a regulação pós-mitocondrial de ativação da caspase, muitos pesquisadores se voltaram para a microinjeção citoplasmática direta de holocytochrome c (heme-anexo) de proteína em células 6-9. Citocromo c é normalmente localizada na mitocôndria onde o apego de um grupo heme é necessária para habilitá-lo para ativar a apoptose 10-11. Portanto, para ativar diretamente caspases, é necessário para injetar a proteína c holocytochrome em vez do seu cDNA, porque enquanto a expressão de citocromo c de construções de cDNA resultará em alvo mitocondrial e apego heme, será seqüestrado de caspases citosólica. Assim, a microinjeção direta citosólica purificada heme ligado à proteína do citocromo c é uma ferramenta útil para imitar mitocondrial citocromo c release e apoptose sem o uso de insultos tóxicos que causam dano celular e mitocondrial. Neste artigo, descrevemos um método para a microinjeção de citocromo c de proteínas em células, usando fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) e primário neurônios simpáticos como exemplos. Embora este protocolo incide sobre a injeção de citocromo c para as investigações da apoptose, as técnicas mostradas aqui também pode ser facilmente adaptado para microinjeção de outras proteínas de interesse.

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Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Neste protocolo, descrevemos a microinjeção direta citoplasmática de citocromo<em&gt; C</em&gt; Proteína em fibroblastos e primário neurônios simpáticos. Esta técnica permite a introdução do citocromo<em&gt; C</em&gt; Proteínas no citoplasma das células e imita a liberação de citocromo<em&gt; C</em&gt; A partir de mitocôndrias, que ocorre durante a apoptose.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Entrevista: apresentação de antígenos glicolipídeos por CD1d eo potencial terapêutico das células NKT Ativação

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Biologia

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

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Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

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Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

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Síntese de um<em&gt; Em vivo</em&gt; Sonda Apoptosis MRI-detectável

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

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Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...