Name: activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH грант NS042197 на MD. AJK была поддержана грантами T32GM008719 и F30NS068006.

1. Производство Микроинъекция иглы <ol><li> Сборные иглы микроинъекции имеются в продаже (например,. Femtotips от Eppendorf) и полезны, если он не выполняет большое количество микроинъекций. Однако, для тех, кто желает установить долгосрочные возможности для microinjecting, альтернативой является пр?...

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+structures+that+shape+caspase+activity,+specificity,+activation+and+inhibition.">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cell+death:+outer+membrane+permeabilization+and+beyond.">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li><li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

Микроинъекции цитохром с непосредственно в цитоплазме клеток является уникальным и мощным инструментом, который позволяет для исследования после митохондриальной регуляции апоптоза. Важно отметить, что эта техника позволяет прямой активации апоптоза вниз по течению митохондр?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> DM IRE2 инвертированного микроскопа </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 Микроинъекция иглы Puller </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 микроманипулятора </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Microinjector </td><td> Эппендорф </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Тонкостенные Boroscilicate Капиллярный Стекло с микрофиламентов </td><td> Системы AM </td><td> 615000 </td><td> 4 дюйма длиной, 1,00 мм наружным диаметром, 0,75 мм, внутренний диаметр </td></tr><tr><td> Родамина Б изотиоцианата-Декстран </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> Средняя молекулярная ~ 70000 Da вес </td></tr><tr><td> Говядине белка цитохром с </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

Апоптоз, или запрограммированная смерть клетки, сохраняется и строго регулируется путь по которому клетки умирают 1. Апоптоз может быть вызван, когда клетки встречи широкий спектр цитотоксического напряжений. Эти оскорбления инициировать сигнальные каскады, которые в конечном итоге вызвать высвобождение цитохрома С из митохондриальных пространства межмембранного в цитоплазму 2. Освобождение цитохрома С из митохондрий является ключевым событием, которое вызывает быструю активацию каспаз, ключ сотовой протеазы, которые в конечном итоге выполнить гибели клеток 3-4. Путь апоптоза регулируется в точках на входе и выходе системы цитохрома релиз с из митохондрий 5. С целью изучения пост-митохондриальной регуляции активации каспазы, многие исследователи обратились к прямым цитоплазматических микроинъекции holocytochrome с (гем-прилагается) белка в клетках 6-9. Цитохром с, как правило, локализованы в митохондриях, где крепление группы гема Необходимо включить его, чтобы активировать апоптоз 10-11. Поэтому, чтобы непосредственно активировать каспазы, необходимо вводить holocytochrome протеина С, а не его кДНК, потому что в то время как экспрессия цитохрома С из кДНК конструкций приведет к митохондриальной адресности и гема вложений, то это будет поглощенных от цитозольного каспазы. Таким образом, прямой цитозольного микроинъекции очищенной гема подключением белка цитохром с является полезным инструментом, чтобы имитировать митохондриальной цитохром-с-релиз и апоптоз без использования токсичных оскорбления, которые вызывают клеточного и митохондриального повреждения. В этой статье мы опишем метод микроинъекции белка цитохрома С в клетках, используя мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) и первичных симпатических нейронов в качестве примеров. Хотя этот протокол фокусируется на введении цитохрома С для исследования апоптоза, методы показано здесь также может быть легко адаптирована для микроинъекции других белков, представляющих интерес.

Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

В этом протоколе описываются прямые цитоплазматические микроинъекции цитохрома<em&gt; С</em&gt; Белка в фибробласты и первичных симпатических нейронов. Эта техника позволяет введение цитохрома<em&gt; С</em&gt; Белков в цитоплазме клетки и имитирует выпуск цитохрома<em&gt; С</em&gt; Из митохондрий, которая происходит во время апоптоза.

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Интервью: Презентация гликолипид антигена CD1d и терапевтический потенциал активации ячейки NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Синтез<em&gt; В естественных условиях</em&gt; МРТ обнаруживаются Апоптоз Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Одиночных молекул изображений регуляции генов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...