Name: activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención NS042197 a MD. Azad Jammu y Cachemira fue apoyado por becas y T32GM008719 F30NS068006.

1. Producción de agujas de microinyección <ol><li> Prefabricados agujas de microinyección están disponibles comercialmente (por ejemplo. Femtotips de Eppendorf) y son útiles si uno no se está realizando un gran número de micro-inyecciones. Sin embargo, para aquellos que desean establecer a largo plazo las capacidades de la microinyección, una alternativa es la producción de agujas de microinyección en el laboratorio con paredes delgadas de vidrio de borosilicato capilares y un extractor de aguja com...

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	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+structures+that+shape+caspase+activity,+specificity,+activation+and+inhibition.">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cell+death:+outer+membrane+permeabilization+and+beyond.">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li><li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

La microinyección de citocromo c directamente en el citoplasma de las células es una herramienta única y poderosa que permite estudios de la regulación post-mitocondrial de la apoptosis. Es importante destacar que esta técnica permite la activación directa de la apoptosis aguas abajo de la mitocondria, sin el uso de agentes que causan daño celular o mitocondrial. Aunque este protocolo se ha centrado en la microinyección de citocromo c para los estudios sobre la apop...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> DM IRE2 microscopio invertido </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 Microinyección Extractor de agujas </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 Micromanipulador </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microinyector </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De pared delgada Boroscilicate capilar de vidrio con microfilamentos </td><td> AM Sistemas </td><td> 615000 </td><td> 4 pulgadas de largo, 1,00 mm de diámetro exterior de 0,75 mm de diámetro interno </td></tr><tr><td> Rodamina B isotiocianato de dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> Peso molecular medio ~ 70.000 Da </td></tr><tr><td> Bovina proteína citocromo c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

La apoptosis, o muerte celular programada, es una vía conservada y muy regulado por el cual las células mueren 1. La apoptosis puede ser activado cuando las células encuentran una amplia gama de tensiones citotóxicos. Estos insultos iniciar cascadas de señalización que pueden llegar a causar la liberación de citocromo c desde el espacio intermembrana mitocondrial al citoplasma 2. La liberación de citocromo c de la mitocondria es un evento clave que desencadena la activación rápida de las caspasas, proteasas celulares claves que finalmente ejecutar la muerte celular 3-4. La vía de la apoptosis está regulada en los puntos aguas arriba y aguas abajo de la liberación del citocromo c de la mitocondria 5. Con el fin de estudiar la regulación post-mitocondrial de activación de las caspasas, muchos investigadores han recurrido a la microinyección directa de citoplasma holocytochrome c (hemo-adjunto) de proteínas en las células 6-9. Citocromo c es normalmente localizada en la mitocondria, donde la unión de un grupo hemo es necesario para poder activar la apoptosis 10-11. Por lo tanto, para activar directamente las caspasas, es necesario inyectar la proteína c holocytochrome en lugar de su cDNA, porque si bien la expresión de citocromo c de las construcciones de cDNA se traducirá en la orientación mitocondrial y el apego del hemo, será secuestrado de caspasas citosólica. Por lo tanto, la microinyección directa citosólica de la proteína purificada hemo-adjunto del citocromo c es una herramienta útil para simular la liberación del citocromo c mitocondrial y la apoptosis, sin el uso de insultos tóxicos que causan daño celular y mitocondrial. En este artículo se describe un método para la microinyección de citocromo c de proteínas en las células, a través del ratón fibroblastos embrionarios (MEFs) y primaria neuronas simpáticas como ejemplos. Aunque este protocolo se centra en la inyección de citocromo c de las investigaciones de la apoptosis, las técnicas mostradas aquí también se puede adaptar fácilmente para la microinyección de otras proteínas de interés.

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Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

En este protocolo, se describe la microinyección directa citoplasma del citocromo<em&gt; C</em&gt; Las proteínas en los fibroblastos y las principales neuronas simpáticas. Esta técnica permite la introducción de la citocromo<em&gt; C</em&gt; Proteínas en el citoplasma de las células e imita la liberación de citocromo<em&gt; C</em&gt; De las mitocondrias, que se produce durante la apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

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Entrevista: Presentación antígeno Glicolípido por CD1d y el potencial terapéutico de la activación de las células NKT

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Investigación

Biología

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