Name: activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c
Uploaded: 2011-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag NS042197 till MD. AJK har finansierats med bidrag T32GM008719 och F30NS068006.

1. Produktion av mikroinjektion Needles <ol><li> Prefabricerade mikroinjektion nålar finns tillgängliga i handeln (t ex. Femtotips från Eppendorf) och är användbara om man inte utför ett stort antal microinjections. Men för dem som vill etablera långsiktiga möjligheter för microinjecting, är ett alternativ att producera mikroinjektion nålar i labbet med tunn vägg borosilikatglas kapillärer och en kommersiell nål avdragare. Detta gör också att formen på nålar som ska varieras, vilket kan var...

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116, 205-219 (2004).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mitochondria+in+apoptosis.">The expanding role of mitochondria in apoptosis.</a> Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).</li><li>Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+apoptosis.">The biochemistry of apoptosis.</a> Nature. 407, 770-776 (2000).</li><li>Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+structures+that+shape+caspase+activity,+specificity,+activation+and+inhibition.">The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition.</a> Biochem. J. 384, 201-232 (2004).</li><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cell+death:+outer+membrane+permeabilization+and+beyond.">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li><li>Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+microinjection+of+cytochrome+c+is+caspase-dependent+and+is+inhibited+by+Bcl-2.">Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2.</a> Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).</li><li>Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+induction+of+apoptosis+by+microinjection+of+cytochrome+c.+Bcl-XL+has+activity+independent+of+cytochrome+c+release.">Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release.</a> J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).</li><li>Deshmukh, M., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+novel+event+during+neuronal+death:+development+of+competence-to-die+in+response+to+cytoplasmic+cytochrome+c.">Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c.</a> Neuron. 21, 695-705 (1998).</li><li>Vaughn, A. E., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+inhibits+apoptosis+in+neurons+and+cancer+cells+by+redox+inactivation+of+cytochrome+c.">Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).</li><li>Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+apoptosis+by+Bcl-2:+release+of+cytochrome+c+from+mitochondria+blocked.">Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.</a> Science. 275, 1129-1132 (1997).</li><li>Gonzales, D. H., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+mitochondrial+c-type+cytochromes.">Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes.</a> J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).</li><li>Ellerby, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+cell-free+system+of+neuronal+apoptosis+-+comparison+of+premitochondrial,+mitochondrial,+and+postmitochondrial+phases.">Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases.</a> J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).</li><li>Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+cytochrome+c+activity+within+intact+neurons+inhibits+apoptosis.">Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis.</a> J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).</li><li>Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

Det mikroinjektion av cytokrom c direkt i cytoplasman av celler är ett unikt och kraftfullt verktyg som möjliggör studier av post-mitokondriella reglering av apoptos. Viktigt ger denna teknik för direkt aktivering av apoptos nedströms mitokondrier utan användning av agenter som orsakar cellulär eller mitokondriell skada. Även om detta protokoll har fokuserat på mikroinjektion av cytokrom c för studier av apoptos, kan de allmänna principerna för protein mikroinje...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> DM IRE2 inverterat mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 mikroinjektion Needle Puller </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikrovågsugnar-202 mikromanipulator </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tunnväggiga Boroscilicate Kapillär Glas med Microfilament </td><td> AM System </td><td> 615 tusen </td><td> 4 tums längd, 1,00 mm ytterdiameter, 0,75 mm innerdiameter </td></tr><tr><td> Rhodamine B isothiocyanat-dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> Genomsnittlig molekylvikt ~ 70 tusen Da </td></tr><tr><td> Bovin cytokrom C Protein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

Apoptos eller programmerad celldöd, är en bevarad och starkt reglerad väg där celler dör 1. Apoptos kan utlösas när celler möter ett brett spektrum av cytotoxisk påfrestningar. Dessa förolämpningar initiera signalering kaskader som i slutändan orsaka utsläpp av cytokrom c från mitokondriens intermembrane utrymmet till cytoplasman 2. Frisättningen av cytokrom c från mitokondrierna är en viktig händelse som utlöser den snabba aktivering av kaspaser, nyckeln cellulära proteaser som i slutändan köra celldöd 3-4. Vägen av apoptos regleras i punkterna uppströms och nedströms om cytokrom c befrielse från mitokondrier 5. För att studera efter mitokondriella reglering av kaspasaktivering har många utredare vänt sig till direkt cytoplasmisk mikroinjektion av holocytochrome c (häm-bifogas) protein i cellerna 6-9. Cytokrom c är normalt lokaliserad till mitokondrierna där fastsättning av en heme grupp är nödvändig för att den för att aktivera apoptos 10-11. Därför direkt för att aktivera kaspaser är det nödvändigt att injicera holocytochrome c protein istället för dess cDNA, eftersom medan uttrycket av cytokrom c från cDNA konstruktioner kommer att resultera i mitokondriernas inriktning och heme kvarstad, kommer det att vara upptagits från cytosoliska kaspaser. Således är den direkta cytosoliskt mikroinjektion av renat heme-anslutna cytokrom c protein ett användbart verktyg för att efterlikna mitokondrie cytokrom c release och apoptos utan att använda giftiga förolämpningar som orsakar cellulär och mitokondriell skada. I den här artikeln beskriver vi en metod för mikroinjektion av cytokrom c protein i cellerna, med musen embryonala fibroblaster (MEFs) och primära sympatiska nervceller som exempel. Även om detta protokoll fokuserar på injektion av cytokrom c för undersökningar av apoptos kan de tekniker som visas här också enkelt anpassas för mikroinjektion av andra proteiner av intresse.

Watch this Scientific Journal Video about Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c at JoVE.com

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

I detta protokoll, beskriver vi den direkta cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom<em&gt; C</em&gt; Protein i fibroblaster och primära sympatiska nervceller. Denna teknik gör det möjligt för införandet av cytokrom<em&gt; C</em&gt; Protein i cytoplasman av celler och härmar frisättningen av cytokrom<em&gt; C</em&gt; Från mitokondrierna, uppstår som under apoptos.

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Intervju: glykolipiden Antigen Presentation av CD1d och den terapeutiska potentialen hos NKT cells aktivering

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analys av mRNA Nuclear Export Kinetics i däggdjursceller genom mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Visualisering av mitokondrie lungfunktion med hjälp av cytokrom C Oxidas / succinatdehydrogenas (COX / SDH) Dubbelklicka märkning Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Syntes av en<em&gt; In vivo</em&gt; MR-detekterbara apoptos Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enda molekyl avbildning av genreglering<em&gt; In vivo</em&gt; Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Analys av apoptos i Zebrafish embryon genom Hela montering Immunofluorescence att upptäcka Aktiverad Caspas 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...