Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

تم تنفيذ هذا العمل من قبل الطلاب الجامعيين في جامعة ولاية ساوث جامعة أوكلاهوما ، ويذرفورد موافق. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني RUI - 0963258 ، NIH OK - INBRE 2P20RR016478 ، وGCAT OCAST HR09 - 137S. تم عزل (ok1468) vsm1 طافرة من قبل الضربة القاضية جين اتحاد أوكلاهوما. المؤلفان بالشكر دان Stefanovic ويلر تانر للمساعدة القيمة التي قدموها أثناء تنفيذ المشروع.

<ol>
	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه الدراسة قمنا بتطوير وسيلة سهلة بروتوكول المستخدم ، الصديقة التي يمكن استخدامها لتحديد ملامح التعبير الجيني الكامن الظواهر البيولوجية المختلفة. في هذا البروتوكول ، وعزله للمرة الأولى RNA الكلي والمعالجة باستخدام الدناز أولا تم لدينا طريقة العزل RNA مبسطة بشكل كبير عن طريق حذف الاستخراج باستخدام راتنجات الفينول وتقارب 5،6 لتنظيف. لفترة وجيزة ، C. وكانت ايليجانس cuticule الخلية أغشية تصدع فتح بواسطة النيماتودا تجميد مع النيتروجين السائل وطحن مع الراتنج الجزيئية. كان يعامل المقبل ، مع استخراج الحمض النووي الريبي أنا الدناز قبل توليف [كدنا]. تم إضافة خطوة لاحقة للحد من التهجين غير محددة ؛ عينات الحمض النووي الريبي ملوثة الجيني يمكن أن أعرض التدخل وتنتج العديد من ايجابيات كاذبة. ثم اكتب البرية وVSM - 1 (ok1468) والموسومة cDNAs متحولة مع Cy3 والتقاط تسلسل Cy5 والمهجنة على C. ميكروأرس ايليجانس الحصول عليها من خلال برنامج GCAT. هذا النظام هو أكثر حساسية من المنتجات المماثلة ، وعلى اللونين تصميم يقلل من عدد من الالواح اللازمة ، مما أدى إلى مزيد من الوقت والتكلفة 7،8 الكفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا النظام لا يتطلب معدات متخصصة لأنظمة أخرى مماثلة ، وبالتالي ، يمكن أن يتحقق هذا الإجراء في أي مكان المختبر القياسية 7. وحللت ، فلوري مجموعة صور المهجنة الثالثة باستخدام برمجيات المصدر المفتوح MAGICTool ، وخلقت ملامح التعبير الجيني. MAGICTool هو برنامج سهل الاستعمال التي يتم استخدامها بسهولة من قبل أفراد من جميع مستويات الخبرة ، من الجامعيين في مرحلة ما بعد الدكتوراه. ومع ذلك ، يتطلب الأداء الأمثل كبيرة توافر الذاكرة. أخيرا ، حصل مرشح الجينات باستخدام التحليل ميكروأري تم التحقق من صحتها مع PCR الوقت الحقيقي. على الرغم من أن نهج الجينومية وسيلة فعالة لدراسة الظواهر البيولوجية ، وهناك بعض القيود ينبغي لأحد أن يأخذ بعين الاعتبار. أولا ، على الرغم من خصوصية هذا البروتوكول ميكروأري ومخطوطات داخل الأسرة لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض إذا ما أخذ قليل النوكليوتيد طبعت من متواليات الحفظ. PCR الوقت الحقيقي يعوض عن أوجه التشابه الجيني داخل الأسرة ، ويمكن التمييز بين الأشكال الإسوية حتى محددة من الجين نفسه. ومع ذلك ، مع PCR الوقت الحقيقي وهو التحدي الحقيقي للعثور على الضوابط التي يتم التعبير عنها على قدم المساواة في جميع أنحاء عمر الكائن الحي. وبسبب هذا ، وسوف تكون النتائج النسبية. نهج البروتين هي واحدة بديلة لأسلوبنا. قد تكون معزولة البروتينات الفردية باستخدام 2D الكهربي الهلامي وتحديدها مع مطياف الكتلة. دراستنا تظهر على وجه التحديد هي التي يسببها العديد من أعضاء الأسرة الحيوانات المنوية الرائد (MSP) البروتين في الديدان الخيطية VSM 1 - متحولة ذات الكثافة متشابك المحسنة. المشروعات المتوسطة الحجم هي فريدة من نوعها لجيم ايليجانس ، وهي المسؤولة عن نضج البويضة والإباضة. وقد أثبتت تشاي (1) التي تسيطر على الأرجح تنظيم عدد وحجم حبة قبل المشبكي عند تقاطع العصبية والعضلية في ذبابة الفاكهة التي تحتوي على جزيئات البروتين المجالات الرئيسية الحيوانات المنوية. وقد أثبتت الدراسات التي أجراها وزملاؤه تسودا 2 المجالات الرئيسية بروتين الحيوانات المنوية قد تكون بمثابة يغاندس لمستقبلات Ephrine مما اثار شلالات مستقبلات التيروزين كيناز الإشارة. علاوة على ذلك ، تحليل PCR الوقت الحقيقي والتحقق من صحة النتائج ميكروأري يضيق الخناق على عضو واحد من عائلة MSP ، MSP - 32. أخذت معا ، والعمل المقدم هنا يمثل تحليل الجينوم واسعة من معضلة الأعصاب المركزية وكذلك السلطة البحوث الجامعية في المسعى العلمي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> كتالوج # </td><td> شركة </td></tr><tr><td> وفي وقت لاحق RNA </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> الجزيئية الراتنج طحن </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy ميني كيت </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز خالية Agarose جنيه </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax الغليسين 10X جل الإعدادية / تشغيل مخزن </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> الحمض النووي الريبي للألفية ماركر </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> غليوكسال نموذج تحميل صبغ </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> تعيين الدناز </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute كيت </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT أنزيم و5X الاحتياطي الرد </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> مجموعة 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick أدوات تنقية PCR </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> المنفصمة الحمض النووي الحيوانات المنوية سالمون </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS الحل </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript كيت التجميعي [كدنا] </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> قريش SYBR الخضراء Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

وتتكون من نقاط الاشتباك العصبي قبل المشبكي منطقة نشطة في الخلية إشارات ومحطة بعد المشبكي في الخلية المستهدفة. في حالة المشابك الكيميائية ، وتنفذ على رسائل كتبها العصبية أطلق سراحهم من قبل المشبكي والمحطات التي تلقتها المستقبلات على الخلايا بعد المشبكي. وقد أظهرت أبحاثنا السابقة في ايليجانس انواع معينة أن VSM - 1 ينظم سلبا إيماس. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل نقاط الاشتباك العصبي في المسوخ 1 - VSM أن الحيوانات التي تفتقر إلى وظيفية بالكامل اتصال متشابك VSM - 1 قد زادت. بناء على هذه النتائج الأولية ، ونحن افترضنا أن جيم قد ايليجانس VSM - 1 تلعب دورا حاسما في synaptogenesis. لاختبار هذه الفرضية ، تم إجراء تحليل المزدوج المسمى ميكروأري ، وتحددت ملامح التعبير الجيني. أولا ، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع كتب reversely ل[كدنا] ، وتهجين للميكروأرس الحمض النووي. ثم ، كشف في والسيليكو تحليل التهجين التحقيق الفلورسنت تحريض كبير من العديد من الجينات الترميز لأفراد من عائلة الحيوانات المنوية البروتين الرئيسية (حركة مجتمع السلم) في المسوخ مع synaptogenesis المحسنة. المشروعات المتوسطة الحجم هي مكون رئيسي من الحيوانات المنوية في C. ايليجانس ويبدو أن الإشارة نضوج البويضة والديدان الخيطية الإباضة. في ذباب الفاكهة ، تظاهر تشاي وزملاؤه MSP (1) التي تشبه جزيئات قبل المشبكي تنظيم عدد وحجم حبة عند تقاطع العصبية والعضلية. وعلاوة على ذلك ، اقترح تحليل أجراه تسودا وزملاء العمل 2 المشاريع متوسطة الحجم التي قد تكون بمثابة يغاندس لمستقبلات أفسس والتيروزين كيناز الزناد شلالات مستقبلات الإشارة. وأخيرا ، أكد تحليل PCR الحقيقي الوقت الذي يتم بفعل الجين الترميز لMSP - 32 - 1 في VSM (ok1468) المسوخ. أخذت معا ، وقد أظهرت الأبحاث التي يقوم بها المختبر في أن VSM - 1 المسوخ وزيادة كبيرة في كثافة متشابك ، والتي يمكن بوساطة إشارات MSP - 32.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

وقد أجري تحليل لتحديد ميكروأري ملامح التعبير الجيني في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; ، وكان يستخدم في الوقت الحقيقي PCR للتحقق من صحة البيانات وتحديد ميكروأري.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear Amplification Mediated PCR ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...