Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
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Ce travail a été réalisé par des étudiants de premier cycle à l&#39;Université d&#39;Oklahoma du sud-ouest d&#39;Etat, OK Weatherford. Ce travail a été soutenu par la NSF RUI-0963258, le NIH OK INBRE 2P20RR016478, GCAT et OCAST HR09-137S. Le vsm1 (ok1468) mutant a été isolé par le Consortium d&#39;Oklahoma inactivation du gène. Les auteurs remercient Dan Stefanovic et Tanner Wheeler pour leur aide précieuse lors de l&#39;exécution du projet.

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	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous avons développé un protocole simple à utiliser, convivial qui peut être utilisé pour déterminer les profils d&#39;expression génique qui sous-tendent divers phénomènes biologiques. Dans ce protocole, l&#39;ARN total a été isolé et traité en utilisant la DNase I. Notre méthode d&#39;isolement d&#39;ARN a été considérablement simplifiée par l&#39;omission des extractions phénol et en utilisant des résines d&#39;affinité pour nettoyer 5,6. Brièvement, C. elegans membranes cellulaires et la cuticule ont été fissurés par les nématodes ouvert la congélation à l&#39;azote liquide et le broyage de la résine moléculaire. Ensuite, l&#39;ARN extrait a été traité à la DNase I avant la synthèse d&#39;ADNc. L&#39;étape ultérieure a été ajouté afin de minimiser les hybridations non spécifiques; échantillons d&#39;ARN contaminés par l&#39;ADN génomique pourrait introduire des interférences et de produire de nombreux faux positifs. Puis, de type sauvage et VSM-1 (ok1468) ADNc mutant ont été marqués avec Cy3 et Cy5 séquences de capture et hybridé sur C. microarrays elegans obtenus par le programme GCAT. Ce système est plus sensible que des produits similaires, et ses deux couleurs de conception diminue le nombre de tableaux nécessaires, résultant en plus de temps et 7,8 coût-efficacité. De plus, ce système ne nécessite pas l&#39;équipement spécialisé d&#39;autres systèmes similaires, par conséquent, cette procédure pourrait être accompli dans n&#39;importe quel environnement de laboratoire standard 7. Troisièmement, les images fluorescentes array hybrides ont été analysés en utilisant le logiciel open source MAGICTool, et les profils d&#39;expression génique ont été créés. MAGICTool est un programme convivial qui est facilement utilisée par des personnes de tous niveaux d&#39;expérience, du baccalauréat au post-doctorat. Toutefois, la performance optimale nécessite la disponibilité de mémoire importante. Enfin, les gènes candidats obtenus en utilisant l&#39;analyse des microréseaux ont été validés avec PCR en temps réel. Bien que l&#39;approche génomique est une méthode efficace pour étudier des phénomènes biologiques, il ya quelques limitations on devrait prendre en considération. Premièrement, en dépit de la spécificité de ce protocole biopuces, les transcriptions sein d&#39;une famille sont indiscernables les uns des autres si l&#39;oligonucléotide imprimée est tirée de séquences conservées. PCR en temps réel compense les similitudes au sein d&#39;une famille de gènes et peut même distinguer entre les isoformes spécifiques d&#39;un même gène. Cependant, avec PCR en temps réel est un défi de trouver des contrôles vrai que s&#39;expriment aussi à travers la durée de vie d&#39;un organisme. Pour cette raison, les résultats seront relatives. Une approche protéomique est une alternative à notre technique. Protéines individuelles peuvent être isolées par électrophorèse en gel 2D et identifiés par spectrométrie de masse. Nos études montrent que spécifiquement nombreux membres de la protéine du sperme Major (MSP) de la famille sont induits dans VSM-1 nématodes mutants avec la densité synaptique accrue. MSP sont uniques à C. elegans et sont responsables de la maturation ovocytaire et l&#39;ovulation. Chai 1 a démontré que la régulation du nombre et la taille de bouton présynaptique de la jonction neuromusculaire chez la drosophile est probable contrôlées par des molécules contenant des domaines majeurs protéine du sperme. Des études menées par Tsuda et ses collègues ont démontré deux principaux domaines de protéine du sperme peut servir de ligands de récepteurs Ephrine, déclenchant des cascades de signalisation du récepteur tyrosine kinase. Par ailleurs, l&#39;analyse PCR en temps réel validé et rétrécie vers le bas les résultats de microréseaux pour un membre de la famille des MSP, MSP-32. Pris ensemble, le travail présenté ici constitue une analyse du génome entier d&#39;un dilemme central des neurosciences ainsi que la puissance de recherche de premier cycle dans l&#39;entreprise scientifique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Catalogue # </td><td> Société </td></tr><tr><td> Plus tard, l&#39;ARN </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Molecular résine de broyage </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Sans RNase agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X gel Prep / Tampon </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> ARN du Millénaire Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal chargement des échantillons Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase jeu </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT enzymatique et Reaction Buffer 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Tableau 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Cisaillé l&#39;ADN de sperme de saumon </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Solution SDS </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> TNT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Kit iScript synthèse d&#39;ADNc </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Les synapses sont composées d&#39;une zone présynaptique actif dans la signalisation cellulaire et un terminal postsynaptique dans la cellule cible. Dans le cas des synapses chimiques, les messages sont transportés par des neurotransmetteurs libérés à partir de terminaux présynaptiques et reçus par des récepteurs sur les cellules post-synaptiques. Nos recherches précédentes chez Caenorhabditis elegans ont montré que VSM-1 régule négativement l&#39;exocytose. De plus, l&#39;analyse de synapses dans VSM-1 mutants montré que les animaux manquent entièrement fonctionnelle connectivité VSM-1 ont augmenté synaptique. Basé sur ces résultats préliminaires, nous avons émis l&#39;hypothèse que C. elegans VSM-1 peut jouer un rôle crucial dans la synaptogenèse. Pour tester cette hypothèse, doublement marquée analyse microarray a été réalisée, et les profils d&#39;expression génique ont été déterminés. Premièrement, l&#39;ARN total a été isolé, inversement transcrit en ADNc et hybridé à l&#39;puces à ADN. Ensuite, l&#39;analyse in silico de l&#39;hybridation sonde fluorescente a révélé induction significative de nombreux gènes codant pour des membres de la famille des protéines du sperme majeure (MSP) en mutants avec synaptogenèse améliorée. MSP sont le principal composant du sperme en C. elegans et semblent signal de maturation ovocytaire et l&#39;ovulation nématodes. Dans les mouches à fruits, Chai et ses collègues ont démontré que 1 MSP-molécules réguler le numéro de bouton présynaptique et la taille à la jonction neuromusculaire. Par ailleurs, l&#39;analyse effectuée par Tsuda et ses collègues suggère que deux MSP peuvent agir comme des ligands de récepteurs Eph et déclencher des récepteurs tyrosine kinase cascades de signalisation. Enfin, l&#39;analyse PCR en temps réel corroboré que le gène codant pour MSP-32 est induite dans VSM-1 (ok1468) mutants. Pris ensemble, les recherches effectuées par notre laboratoire a montré que VSM-1 mutants ont une augmentation significative de la densité synaptique, qui pourraient être médiés par MSP-32 de signalisation.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

L&#39;analyse par microréseau a été menée pour déterminer les profils d&#39;expression génétique dans<em&gt; C. elegans</em&gt;, Et PCR en temps réel a été utilisée pour valider et quantifier les données de biopuces.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

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