Name: determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Эта работа была выполнена студентами в Юго-западном университете штата Оклахома, Weatherford ОК. Эта работа была поддержана NSF RUI-0963258, NIH ОК-INBRE 2P20RR016478, GCAT и OCAST HR09-137S. Vsm1 (ok1468) мутант был изолирован Нокаут гена Консорциум Оклахоме. Авторы благодарят Дэн Стефанович и Таннер Уилер за их неоценимую помощь во время выполнения проекта.

<ol>
	<li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hVAPB,+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans,+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction.">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li><li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved,+secreted,+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors.">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li><li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles.">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li><li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis.">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li><li>Vi&#241;uela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans.">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li><li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor.">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li><li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF,+a+conserved+stem+cell+regulator.">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li><li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain.">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

В этом исследовании мы разработали простой, удобный протокол, который может быть использован для определяться профили экспрессии генов основного различных биологических явлений. В этом протоколе общего количества РНК был впервые выделен и лечить с помощью ДНКазы I. Наш метод выделения РНК была значительно упрощена, опустив фенола извлечения и использования сродство смолы для очистки 5,6. Одним словом, С. Элеганс кутикулу и клеточных мембран потрескались открытым путем замораживания нематод с жидким азотом и шлифовальные с молекулярной смолы. Далее, извлеченные РНК обрабатывали ДНКазы я перед синтеза кДНК. Позднем этапе был добавлен в минимизации неспецифической гибридизации; РНК образцы загрязненной геномной ДНК может ввести помехи и производить много ложных срабатываний. Затем, дикого типа и VSM-1 (ok1468) мутант кДНК были помечены Cy3 и Cy5 последовательности захвата и гибридизированных на С. Элеганс микрочипов получены через GCAT программы. Эта система является более чувствительным, чем аналогичные продукты, а его двухцветным дизайном уменьшается число массивов, необходимых, в результате чего больше времени и экономической эффективности 7,8. Кроме того, эта система не требует специального оборудования других подобных систем, поэтому эта процедура может быть выполнена в любом стандартов лаборатории 7. В-третьих, флуоресцентные изображения гибридизированных массиве были проанализированы с использованием открытых MAGICTool исходным кодом, а также профили экспрессии генов были созданы. MAGICTool это удобная программа, которая легко использоваться физическими лицами всех уровней опыта, от бакалавра до пост-докторантуры. Тем не менее, оптимальной производительности требует больших доступность памяти. Наконец, генов-кандидатов, полученные с помощью микрочипов анализа были проверены с ПЦР в реальном времени. Хотя геномный подход является эффективным методом изучения биологических явлений, Есть некоторые ограничения, следует принимать во внимание. Во-первых, несмотря на специфичность данного протокола микрочипов, расшифровки в семье ничем не отличаются друг от друга, если печатные олигонуклеотидных взята из сохраняется последовательностей. ПЦР в реальном времени компенсирует сходство в пределах семейства генов и даже могут различать конкретные изоформ одного и того же гена. Однако, с ПЦР в реальном времени это вызов, чтобы найти истинные элементы управления, которые выражены одинаково всей жизни организма. Из-за этого результаты будут относительными. Протеомных подход является одним альтернатива нашей техники. Индивидуальные белки могут быть выделены с использованием 2D гель-электрофореза и отождествляется с масс-спектрометрии. Наши исследования показывают, в частности, что многие члены Основные спермы белков (MSP) семья индуцированных в VSM-1 мутант нематод с повышенной синаптической плотности. ПСМ являются уникальными для C. Элеганс и отвечают за созревание яйцеклетки и овуляции. Чай 1 показал, что регулирование числа пресинаптических Bouton и размер в нервно-мышечном соединении у плодовых мушек, скорее всего, контролируется молекулами, содержащими основные области белка спермы. Исследования Цуда и его коллеги продемонстрировали два основных областях белка спермы может служить в качестве лигандов для Ephrine рецепторы, вызывая рецепторов тирозинкиназы сигнальные каскады. Кроме того, ПЦР в реальном времени анализ проверены и сузили микрочипов результаты одного из членов семьи MSP, MSP-32. Взятые вместе, работы, представленные здесь представляет генома анализа дилеммы центральной неврологии, а также сила бакалавриата исследований в научной деятельности.

<table border="1"><tbody><tr><td> Компонент </td><td> Каталог # </td><td> Компания </td></tr><tr><td> Позже РНК </td><td> AM7020 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> Молекулярная шлифовальные Смола </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> РНКазы без агарозном LE </td><td> AM9040 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Гель Prep / бег буфера </td><td> 8678 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> РНК тысячелетия Маркер </td><td> AM7150 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> Глиоксаль Пример Загрузка Dye </td><td> 8551 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> ДНКазы набор </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT ферментов и 5X буфера реакции </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Массив 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick ПЦР Очистка Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Стриженый ДНК спермы лосося </td><td> AM9680 </td><td> Амбион </td></tr><tr><td> Решение SDS </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript кДНК Kit Синтез </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

determining genetic expression profiles in c. elegans using microarray and real-time pcr

Синапсы состоят из пресинаптических активной зоны сигнализации клетки и постсинаптической терминала в клетки-мишени. В случае химических синапсов, сообщения переносятся нейротрансмиттеров освобождены из пресинаптических окончаний и полученные рецепторами на постсинаптической клетки. Наши предыдущие исследования в Caenorhabditis Элеганс показал, что VSM-1 негативно регулирует экзоцитоза. Кроме того, анализ синапсов в VSM-1 мутантов показал, что животные не хватает полнофункциональную VSM-1 увеличилась синаптические связи. Основываясь на этих предварительных результатах, мы предположили, что С. Элеганс ВСМ-1, могут играть решающую роль в синаптогенез. Чтобы проверить эту гипотезу, дважды меченных микрочипов анализ был проведен, а также профили экспрессии генов были определены. Во-первых, общая РНК выделяли, обратно транскрибируется в кДНК и гибридизации с ДНК-микрочипов. Затем, в кремний-анализа флуоресцентной гибридизации зонд выявил значительные индукции многих генов, кодирующих членов семьи основных белков спермы (MSP) в мутантов с повышенной синаптогенез. ПСМ являются основным компонентом спермы на языке C. Элеганс и, похоже, сигнал нематоды созревание ооцитов и овуляции. В плодовых мушек, чай и его коллеги показали, что один MSP-подобных молекул регулировать пресинаптические количество и размер Bouton в нервно-мышечном соединении. Более того, анализ, проведенный Цуда и сотрудниками 2 предполагает, что ПСМ могут выступать в качестве лигандов рецепторов Еф и вызвать рецепторов тирозинкиназы сигнальные каскады. Наконец, ПЦР в реальном времени анализ подтвердил, что ген, кодирующий MSP-32 индуцируется в VSM-1 (ok1468) мутантов. Взятые вместе, исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, что VSM-1 мутанты значительное увеличение синаптической плотности, которые могут быть опосредованы MSP-32 сигнализации.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR at JoVE.com

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray анализ был проведен для определения генетических профилей выражение в<em&gt; С. Элеганс</em&gt;, А ПЦР в реальном времени была использована для проверки и количественной микрочипов данных.

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Биохимические и высокая пропускная способность Микроскопическая оценка жировой массы в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear Amplification Mediated PCR ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...