Name: a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

وأيد هذا العمل عن طريق البحث الاسترالي غرانت DP0986937 المجلس.

<ol>
	<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy.">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li><li>Kroemer, G., Mari&#241;o, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li><li>Camougrand, N., Kissov&#225;, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitophagy+in+yeast.">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li><li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+live+long+and+prosper:+autophagy,+mitochondria,+and+aging.">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li><li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy.">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li><li>Bhatia-Kissov&#225;, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+in+yeast:+actors+and+physiological+roles.">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li><li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast.">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li><li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K+/H++exchange+activity,+osmotic+swelling+and+mitophagy.">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li><li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags.">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li><li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosella:+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast.">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في الصور المعروضة في شكل تمثيلية. ويمكن 2B 2C يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح أن استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت ومضان المجهري توفر أدلة على توطين الميتوكوندريا / التوزيع في كل من النمو والخلايا النيتروجين المتعطشة ، ويسمح mitophagy أن تصور. فمن ينبغي التأكيد على أن لا يقتصر هذا الأسلوب لmitophagy التالية. يمكن رصد الالتهام الذاتي من المكونات الخلوية الأخرى أو العضيات (على سبيل المثال ، ريبوسوم ، قطرات الدهون ، peroxisomes ، شبكية هيولي باطني والنواة) مع وضع العلامات المناسبة. وقد ذكرت تفاصيل عن بناء جهاز الاستشعار البيولوجي روزيلا ، والظروف والنتائج خلية ثقافة نموذجية لدوران النواة (nucleophagy) 11،12 توضح التوسع في تطبيق الأسلوب. استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت لرصد الالتهام الذاتي يتطلب أن تبقى عدة اعتبارات تصميم بناء في الاعتبار. وهذه تشمل : (1) اختيار والانصهار في إشارة إلى مناسبة تستهدف تحقيق عضية محددة الاستهداف ؛ (2) اختيار البروتين الفلوري المناسبة (ق) ، (3) الانبعاثات مضان قوية ؛ (4) توطين عضية الصحيح و / أو التوزيع داخل الخلية. بمجرد مراسل عضية محددة أعرب بنجاح في استضافة الخميرة اختيار سلالة المجموعة الثانية من الاعتبارات يصبح : (1) ظروف نمو الخميرة ، (2) إعداد نموذج الخلية ؛ (3) معلمات التصوير كما أنه من المهم أن المعلمات المختارة لCLSM (على سبيل المثال ، وكثافة الليزر ، وفحص معدل واسطة ، قيمة ذات الثقب ، وقيمة التكبير وأهدافها المستخدمة أو التعرض للكاميرا CCD) تمسك طوال تجربة ضمان إمكانية إجراء مقارنات بين السيطرة (خلايا النمو) وعينات جوعا ؛ ( 3) الحث الالتهام الذاتي وناجحة تسليم الصحفي إلى فجوة. عموما ، هذا الأسلوب المجهري الفلورسنت سهلة وسريعة نسبيا ، والتطبيق المحتمل لفحص إنتاجية عالية على المخدرات الرواية التي تعزز أو تعيق الالتهام الذاتي ، وأيضا عن الجينات التي تنظم أو تعدل الالتهام الذاتي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف / المعدات </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> السكيراء الجعوية EasyComp تحويل كيت </td><td> Invitrogen </td><td> K5050 - 01 </td></tr><tr><td> الخميرة قاعدة النيتروجين دون الأحماض الأمينية وكبريتات الامونيوم </td><td> دينار بحريني Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> انخفاض ذوبان agarose </td><td> PROGEN العلوم البيولوجية </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> شرائح مجهرية (76 × 26 ملم) </td><td> منزل - جلاسر </td><td></td></tr><tr><td> coverslips المجهر (22 × 22 ملم) </td><td> منزل - جلاسر </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> ليزر متحد البؤر المسح الضوئي مجهر Fluoview FV500 </td><td> اوليمبوس </td><td></td></tr><tr><td> الارجنتين تواجه المركز. </td><td> Moleular مجسات - Invitrogen </td><td> Y - 7531 </td></tr></tbody></table> جميع التركيزات المعطاة ث / ت ، ما لم يرد خلاف ذلك. متوسط ​​الحد الأدنى من الخميرة (YMM) : 0.67 ٪ النيتروجين قاعدة الخميرة دون الأحماض الأمينية والغلوكوز 2 ٪ ، 1.5 ٪ أجار (المضافة فقط عندما جعل وسائل الاعلام الصلبة) وأية ملاحق عونية التغذي المطلوبة (0.01 ٪)]. السكيراء الأملاح (SS) : (NH 4) 2 S0 4 ، 0.12 ٪ ؛ KH 2 PO 4 ، 0.10 ٪ ، 0.6 MgC1 2 H2O ، 0.07 ٪ ؛ NaC1 ، 0.05 ٪ ؛ CaCl2 ، 0.01 ٪ ؛ FeC1 3 ، 0،0005 ٪. متوسطة النمو : SS والإيثانول 2 ٪ (V / V) والمكملات عونية التغذي المناسبة. النيتروجين التجويع المتوسط ​​: 0.17 ٪ النيتروجين قاعدة الخميرة دون الأحماض الأمينية وكبريتات الامونيوم (Difco) ، والإيثانول 2 ٪ (V / V).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

الالتهام الذاتي المهم للدوران من المكونات الخلوية في ظل مجموعة من الظروف المختلفة. أنها تخدم وظيفة أساسية استتبابي فضلا عن آلية لمراقبة الجودة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي وتتحلل المادة الخلوية بما في ذلك 4 - organelles1. على سبيل المثال ، تضررت أو زائدة الميتوكوندريا (الشكل 1) ، وليس التخلص منها عن طريق الالتهام الذاتي يمكن أن تمثل تهديدا للتوازن الخلوية وبقاء الخلية. في الخميرة ، خميرة يمكن السكيراء ، والحرمان من المواد الغذائية (مثل المجاعة النيتروجين) أو الضرر تعزيز دوران الانتقائي للالميتوكوندريا التي الالتهام الذاتي في عملية تسمى mitophagy 5-9. وصفنا بسيطة نهج المجهري مضان لتقييم الالتهام الذاتي. من أجل الوضوح ونحن لدينا وصف تقييد هنا لاظهار كيف يمكن استخدام نهج لرصد mitophagy في خلايا الخميرة. ويجعل من استخدام مقايسة مراسل الفلورسنت ، روزيلا ، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي المزدوجة الانبعاثات يضم الحموضة مستقرة نسبيا بروتين فلوري الأحمر مرتبطة بروتين درجة الحموضة حساسة الفلورية الخضراء. تشغيل هذا المراسل تعتمد على الاختلافات في درجة الحموضة بين (5،0-5،5 درجة الحموضة ~) فجوة والميتوكوندريا (درجة الحموضة ~ 8.2) في الخلايا الحية. تحت ظروف النمو ، وخلايا النوع البري يحمل كل مضان أحمر وأخضر وزعت في طريقة مميزة في الميتوكوندريا. لا يرتبط مضان الانبعاثات مع فجوة. عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين ، وهو الشرط الذي يدفع mitophagy ، بالإضافة إلى مضان أحمر وأخضر وصفها الميتوكوندريا ، والخلايا يحمل تراكم الحمراء ، ولكن لا مضان أخضر ، في التجويف وفجوي الحمضية يمثل تسليم الميتوكوندريا إلى فجوة. احرز مع الخلايا الحمراء ، ولكن يمكن استخدام الفجوات الفلورية الخضراء لا كمقياس للنشاط في الخلايا mitophagic 5،10-12.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

ووصف نهج قوي لمراقبة تسليم العضيات لمعة الحامضية للفجوة الخميرة للتحلل وإعادة التدوير. الأسلوب يعتمد على وضع العلامات المحددة الهدف العضيات مع مضان المزدوجة الانبعاثات المرمزة وراثيا الحموضة ، جهاز الاستشعار البيولوجي ، والتصور من الخلايا الفردية باستخدام المجهر مضان.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...