Name: a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי גרנט DP0986937.

<ol>
	<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy.">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li><li>Kroemer, G., Mari&#241;o, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li><li>Camougrand, N., Kissov&#225;, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitophagy+in+yeast.">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li><li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+live+long+and+prosper:+autophagy,+mitochondria,+and+aging.">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li><li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy.">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li><li>Bhatia-Kissov&#225;, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+in+yeast:+actors+and+physiological+roles.">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li><li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast.">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li><li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K+/H++exchange+activity,+osmotic+swelling+and+mitophagy.">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li><li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags.">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li><li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosella:+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast.">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בתמונות שהוצגו נציג איור. 2B ו - 2C ניתן לראות בבירור כי השימוש אברון ספציפי כתבים פלורסנט מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק ראיות של לוקליזציה והפצה המיטוכונדריה / בגידול והן חנקן מורעבים התאים, ומאפשר mitophagy להיות דמיינו. זה יש להדגיש כי שיטה זו אינה מוגבלת mitophagy הבאה. Autophagy של מרכיבים תאיים אחרים או אברונים (למשל, הריבוזומים, טיפות השומנים, peroxisomes, reticulum endoplasmic ואת הגרעין) עשוי להיות במעקב עם תיוג מתאים. פרטי לבנות את biosensor רוזלה, תרבות תנאים התא תוצאות אופייני מחזור של גרעין (nucleophagy) דווחו 11,12 הממחישות את היישום הרחב יותר של השיטה. השימוש אברון ספציפי כתבים ניאון עבור autophagy ניטור דורש כמה שיקולים של תכנון לבנות כדי לזכור. אלה כוללים: (1) סלקציה היתוך האות המיקוד המתאים כדי להשיג אברון ספציפי מיקוד, (2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי מתאים (ים): (3) פליטת הקרינה חזקה; (4) לתקן לוקליזציה אברון ו / או חלוקה בתוך התא. לאחר הכתב אברון ספציפי באה לידי ביטוי בהצלחה מארח את השמרים נבחר זן קבוצה שנייה של שיקולים להיות: (1) צמיחה שמרים תנאים; (2) מדגם הכנה התא; (3) הדמיה פרמטרים כמו חשוב הפרמטרים שנבחרו עבור CLSM (למשל, עוצמת הלייזר, סריקה קצב ומצב, ערך חריר, ערך הזום, מטרות שימוש או חשיפה CCD-מצלמה) נשמרות לאורך ניסוי להבטיח כי ניתן לבצע השוואות בין שליטה (תאים גדל) דגימות רעב: ( 3) אינדוקציה autophagy ומוצלחת המסירה של כתב לתוך vacuole. בסך הכל, זו שיטה מיקרוסקופית פלורסנט קל, מהיר יחסית, ויש לו פוטנציאל היישום ההקרנה תפוקה גבוהה עבור תרופות חדישות המשפרות או לעכב autophagy, וכן גנים המווסתים או לווסת autophagy.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp טרנספורמציה Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו אמוניום סולפט </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> התכה נמוכה agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות (76 x 26 מ&quot;מ) </td><td> Menzel-גלזר </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ coverslips (22 x 22 מ&quot;מ) </td><td> Menzel-גלזר </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> לייזר Confocal סריקת מיקרוסקופ Fluoview FV500 </td><td> אולימפוס </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular בדיקות-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> כל ריכוזי נתון w / v, אלא אם צוין אחרת. שמרים בינוני מינימלי (YMM): 0.67% חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו, גלוקוז 2%, אגר 1.5% (מוסף רק בעת ביצוע התקשורת מוצק) וכל תוספי auxotrophic הנדרש (0.01%)]. Saccharomyces מלחים (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0.12%; KH 2 PO 4, 0.10%, 0.6% MgC1 2 H2O, 0.07; NaC1, 0.05%; CaCl2, 0.01%; FeC1 3, 0.0005%. בינוני צמיחה: אס ואתנול 2% (v / v) ותוספי auxotrophic המתאים. חנקן רעב בינוני: 0.17% חנקן שמרים ללא בסיס חומצות אמינו אמוניום סולפט (Difco), 2% אתנול (v / v).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

Autophagy חשוב מחזור של רכיבים סלולריים תחת מגוון של תנאים שונים. זה ממלא תפקיד חיוני homeostatic וכן בקרת איכות מנגנון שיכול היעד סלקטיבי לבזות חומר הסלולר כולל organelles1-4. לדוגמה, פגום או מיותר המיטוכונדריה (איור 1), לא מסולק על ידי autophagy, יכול לייצג איום על הומאוסטזיס הסלולר הישרדות התא. ב השמרים, Saccharomyces cerevisiae, חסך תזונתי (למשל, רעב חנקן) או נזק יכול לקדם מחזור סלקטיבית של המיטוכונדריה על ידי autophagy בתהליך שמכונה mitophagy 5-9. אנו מתארים גישה פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך autophagy. לשם הבהירות אנו להגביל את התיאור שלנו כאן כדי להראות עד כמה הגישה ניתן להשתמש כדי לפקח mitophagy בתאי שמרים. Assay עושה שימוש כתב ניאון, רוזלה, המהווה biosensor כפול הפליטה הכוללת חלבון יחסית-pH יציב ניאון אדום קשור חלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק. המבצע של הכתב הזה מסתמך על ההבדלים בין ה-pH (5.0-5.5 pH ~) vacuole ו (pH 8.2 ~) המיטוכונדריה בתאים חיים. תחת תנאי גידול, סוג התאים בר התערוכה הן פלואורסצנטי אדום וירוק מופץ מאפיין בצורה של המיטוכונדריה. פליטת הקרינה לא קשורה vacuole. כאשר נתון רעב חנקן, מצב אשר גורם mitophagy, בנוסף פלואורסצנטי אדום וירוק תיוג במיטוכונדריה, תאים התערוכה הצטברות של האדומים, אבל לא פלואורסצנטי ירוק, את לומן vacuolar חומצי המייצג את המסירה של המיטוכונדריה כדי vacuole. ניקוד תאים עם אדום, אבל vacuoles ניאון ירוק לא יכול לשמש כמדד לפעילות mitophagic בתאים 5,10-12.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...