Name: a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Эта работа была поддержана Австралийский исследовательский совет Грант DP0986937.

<ol>
	<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy.">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li><li>Kroemer, G., Mari&#241;o, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li><li>Camougrand, N., Kissov&#225;, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitophagy+in+yeast.">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li><li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+live+long+and+prosper:+autophagy,+mitochondria,+and+aging.">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li><li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy.">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li><li>Bhatia-Kissov&#225;, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+in+yeast:+actors+and+physiological+roles.">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li><li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast.">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li><li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K+/H++exchange+activity,+osmotic+swelling+and+mitophagy.">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li><li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags.">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li><li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosella:+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast.">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

В представителю изображений представлена ​​на рис. 2В и 2С можно ясно видеть, что использование органелл конкретной флуоресцентные репортеров и флуоресцентной микроскопии, свидетельствует о митохондриальной локализации / распределения в обоих растет и азота с нехваткой клетки, а также позволяет mitophagy для визуализации. Следует подчеркнуть, что этот метод не ограничивается следующими mitophagy. Аутофагия других клеточных компонентов или органеллы (например, рибосомы, липидные капли, пероксисом, эндоплазматический ретикулум и ядро), могут быть проверены с подходящим маркировки. Информация о построить Розелла биосенсор, условиях культуры клеток и типичные результаты за оборотом ядра (nucleophagy) были зарегистрированы 11,12 иллюстрирующих более широкого применения этого метода. Использование органелл конкретной флуоресцентные журналистам мониторинга аутофагии требует нескольких соображений построить дизайн будет иметь в виду. К ним относятся: (1) выбор и слияние в соответствующие ориентации сигнала для достижения органелл-таргетинга, (2) Выбор подходящего флуоресцентный белок (ы), (3) сильная флуоресценция выбросов; (4) правильная локализация органелл и / или распределение внутри клетки. После органелл конкретных репортер успешно выражается в выбранной дрожжей хост напряжение второй группы стали соображения: (1) рост дрожжей условиях; (2) клетка пробоподготовки, (3) визуализации параметров, как важно, чтобы выбранные параметры для CLSM (например, интенсивности лазерного излучения, скорость сканирования и режим, обскуры значение, значение масштаба, целей используются или экспозиции для CCD-камера) ведутся по всему эксперимент обеспечение того, чтобы сравнения можно провести между контрольными (растущих клеток) и голодали образцов; ( 3) аутофагии индукции и успешной сдачи репортером в вакуоли. В целом, это флуоресцентного метода микроскопии легко, относительно быстро, и потенциальное применение для высокопроизводительного скрининга для новых препаратов, которые усиливают или тормозят аутофагии, а также для генов, которые регулируют или модулировать аутофагии.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента / оборудование </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Saccharomyces CEREVISIAE EasyComp Преобразование Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Дрожжи азотистого основания без аминокислот и сульфата аммония </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Низкий плавления агарозы </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Микроскоп слайды (76 х 26 мм) </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td></tr><tr><td> Микроскоп покровные (22 х 22 мм) </td><td> Menzel-Glaser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Fluoview FV500 </td><td> Олимп </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Зонды-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Все концентрации указаны только вес / объем, если не указано иное. Дрожжи минимальной среде (УММ): 0,67% азота базы дрожжей без аминокислот, 2% раствор глюкозы, 1,5% агар (добавлено только при принятии твердой среде), а также все необходимые добавки ауксотрофных (0,01%)]. Saccharomyces Соли (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%, KH 2 PO 4, 0,10%; MgC1 2 0,6 H 2 O, 0,07%; NaC1, 0,05%, CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Рост средний: СС и 2% этанола (об. / об) и соответствующие дополнения ауксотрофных. Азот-голод среды: 0,17% азота базы дрожжей без аминокислот и сульфата аммония (Difco), 2% этанола (об. / об).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

Аутофагия имеет важное значение для оборота клеточных компонентов в диапазоне различных условий. Она служит основной гомеостатической функции, а также механизм контроля качества, которые могут быть нацелены и выборочно ухудшить клеточного материала в том числе organelles1-4. Например, поврежденные или избыточным митохондрий (рис. 1), а не уничтожать путем аутофагии, может представлять угрозу для клеточного гомеостаза и выживаемость клеток. В дрожжи, Saccharomyces CEREVISIAE, питательных веществ лишения (например, азота голодания) или повреждение может способствовать селективный оборот митохондрий аутофагии в процесс, который называют mitophagy 5-9. Мы опишем простой подход флуоресценции микроскопии для оценки аутофагии. Для наглядности мы ограничимся описанием здесь, чтобы показать, как этот подход может быть использован для мониторинга mitophagy в клетках дрожжей. Анализа используются люминесцентные репортер, Розелла, который двойного излучения биосенсор включающий относительно стабильным рН-красный флуоресцентный белок связан с рН-чувствительных зеленого флуоресцентного белка. Действие настоящего репортера опирается на различия в рН между вакуоль (рН ~ 5,0-5,5) и митохондриях (рН ~ 8,2) в живых клетках. Под условия выращивания, дикие клетки типа выставку как красный и зеленый флуоресценции распределяться таким образом, характерный для митохондрий. Флуоресценция выбросов не связано с вакуоли. Когда подвергают азотного голодания, состояние, которое вызывает mitophagy, помимо красного и зеленого свечения маркировки митохондрий, клеток выставку накопления красный, но не зеленая флуоресценция, в кислой вакуолярной просвет представляющих доставки митохондрий вакуоли. Скоринг клетки с красными, но не зеленый флуоресцентный вакуоли могут быть использованы в качестве меры mitophagic активности в клетках 5,10-12.

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Надежный подход для контроля доставки органелл на кислых просвет дрожжей вакуоль для деградации и утилизации описано. Метод основан на конкретных маркировки целевой органелл с генетически закодированы двойного излучения флуоресценции рН-биосенсоров и визуализации отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в Saccharomyces CEREVISIAE

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...