Name: multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Matthew O&#39;Sullivan en Fei Zhou zijn de ontvangers van de Australische National Health en Medical Research Council Postgraduate Medical Research beurzen.

Een zorgvuldige afweging moet worden besteed aan primer en probe design. Alle beschikbare sequenties van de doelstellingen van de interesse van databases zoals GenBank moeten worden gebruikt om behouden gebieden die geschikt zijn targets te identificeren. Waar een groot aantal van de doelstellingen worden versterkt in een mPCR assay, moet elke geamplificeerde sequentie zijn van vergelijkbare lengte, en mag niet hoger zijn dan 300 basenparen om de concurrentie te voorkomen. Een alternatieve toepassing van de methode is om een ​​langer richten met behulp van primers tegen geconserveerde gebieden te versterken en om meerdere sondes te gebruiken om sequentievariatie identificeren op het amplicon. In dit geval kan het geamplificeerde PCR-product langer zijn. Primer annealing temperaturen moeten allemaal gelijk zijn, met de PCR-condities aangepast. Primers die een sterke secundaire structuur of primer dimeer vorm moet worden vermeden. De Sigma Aldrich DNA-calculator ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) kan worden gebruikt om betrouwbaar te voorspellen deze functies. DNA-probes moet worden ontworpen te hebben annealing temperaturen dicht bij de 60 ° C. Voor een maximale specificiteit, kunnen twee probes voor elke doelgroep van belang zijn opgenomen in de test, een hybridiseren naar voren DNA-streng grenzend aan de reverse primer bindingsplaats, en de andere aan het omgekeerde streng grenzend aan de forward primer bindingsplaats. In dit geval moeten zowel vooruit als achteruit primers worden biotine-gewijzigd. Als er slechts een probe per versterkt doel wordt gebruikt, dan is er slechts een primer nodig biotine gewijzigd. Bij het ​​ontwerpen van primers en probes voor de mPCR / RLB-test is het sterk aangeraden om te gebruiken in silico methoden om PCR-producten en de probe hybridisatie te voorspellen te correleren met de in vitro resultaten. Idealiter wordt dit gedaan met isolaten waarvan het hele genoom sequentie beschikbaar is. Software zoals FastPCR (beschikbaar op http://primerdigital.com/fastpcr.html) kan worden gebruikt voor dit doel. Zwak of afwezig probe-signaal kan worden voorspeld waar in silico analyse blijkt basepaar mismatches resulteert in een lage probe annealing temperaturen. DNA-extractie technieken zullen variëren afhankelijk van de monsters wordt getest, en PCR-condities zal afhankelijk zijn van primer design. Lezers wordt verwezen naar publicaties over de individuele testen voor meer informatie over DNA-extractie en de PCR-reagentia en condities 1-19. Elke test is uitgevoerd met passende controles ten minste een positief en een negatief sonde signaal voor elke probe op het membraan, evenals een DNA-free controle te bieden. Verder is het nuttig om een ​​sonde ook aan de bovenkant van het membraan dat naar verwachting positief zijn voor alle monsters (bijvoorbeeld: een soort of genus-specifieke probe in het geval van een micro-organisme). Dit dient als een positieve controle sonde, maar maakt ook eenvoudig oriëntatie van de resultaten. 1. Voorbereiding van de Membraan <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: <ul><li> 100 ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml 16% EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - plaats in waterbad bij 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Verwarm de oven voor op 60 ° C. </li><li> Reinig de Immunetics Miniblotter met 70% ethanol. </li><li> Verdun de oligonucleotide probes in 0,5 M NaHCO 3 tot een uiteindelijke concentratie van 2 pmol / pl en een volume van 200 pi. </li><li> Snijd een BiodyneC nylon membraan naar 15x15 cm. Met behulp van een potlood en liniaal, regel uit een 0,5 cm ruimte over de bovenkant van membraan en hier schrijven details. </li><li> Seal membraan in een plastic zak met 20 ml vers gemaakte 16% EDAC-oplossing en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Was membraan in gedemineraliseerd water gedurende 30 seconden. </li><li> Plaats membraan in miniblotter met kanalen die dwars over het membraan (parallel aan potlood lijn). Zet ondersteuning kussen op zijn plaats en sluit vloeipapier. Aspireren vocht uit kanalen. </li><li> Vul de lanen 1 en 45 met 150 ul 0,5 M NaHCO 3. Gebruik 150 ul van elke probe-oplossing van rijstrook 2-44 in de juiste volgorde te vullen, let daarbij goed op luchtbellen te voorkomen. Als een luchtbel wordt weergegeven in het kanaal, het bijhouden van de pipet op zijn plaats, snel de oplossing te zuigen om de luchtbel te zweven naar de top van de pipet en probeer opnieuw. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren probe-oplossingen, verwijder membraan en was in 250 ml 0,1 M NaOH bij kamertemperatuur gedurende 9 minuten. </li><li> Was membraan in 250 ml 2xSSPE gedurende 30 seconden. </li><li> Was membraan in 250 ml voorverwarmde 2xSSPE/0.1% SDS in de oven op 60 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Indien niet wordt gebruikt voor hybridisatie onmiddellijk, membraan was in 240 ml 20 mM EDTA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten (het reserveren van de resterende 10 ml), vervolgens seal membraan in een plastic zak met de resterende 10 ml 20 mM EDTA en store in de koelkast bij 4 ° C. </li><li> Was miniblotter met Pyroneg reinigingsmiddel en borstel. Afspoelen en laten drogen. </li></ol> 2. Hybridisatie en Detectie <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - op te slaan in een waterbad bij 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - op te slaan in een waterbad bij 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - op te slaan in de oven op 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - bewaren bij kamertemperatuur </li><li> 500 ml 1% SDS - op te slaan in een waterbad bij 60 ° C in eerste instantie (voor stap 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - Bewaren bij kamertemperatuur (voor stap 3). </li></ul></li><li> Zet een oven op 60 ° C en een oven voor op 42 ° C. Breng het water aan de kook in een grote bak op een kookplaat. </li><li> Schoon Immunetics Miniblotter met 70% ethanol. </li><li> Aliquot 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS in een kleine container. Voeg 20 ui van elk PCR-product tot 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS in genummerde buizen. </li><li> Kook PCR-producten gedurende 10 min bij 100 ° C met behulp van piepschuim houders. Onmiddellijk plaats op ijs gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Was membraan in de resterende 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS bij 60 ° C oven gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats membraan in miniblotter met backing kussen. Oriënteren zodat kanalen lopen verticaal (loodrecht op potlood lijn). </li><li> Zuiging overtollige vloeistof uit miniblotter kanalen. </li><li> Voeg de resterende 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS de eerste en de laatste kanalen. Voeg gekookt PCR-producten om de resterende kanalen (alleen 2-44) in de juiste volgorde, en let om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Plaats miniblotter flat in 60 ° C oven gedurende 1 uur, om het hybridisatie te laten plaatsvinden. </li><li> Aspireren vloeistof van elk kanaal en verwijder membraan van miniblotter. </li><li> Was twee keer in voorverwarmde 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS bij 60 ° C oven gedurende 10 minuten. </li><li> Bevochtig nylon scheiden van gaas met 2xSSPE/0.5% SDS bij 42 ° C en gebruik het op te rollen membraan. </li><li> Plaats opgerold membraan naar rolbuis, en ontplooien om ervoor te zorgen membraan grenst aan de binnenkant. Voeg 3 il streptavidine-peroxidase conjugaat (Roche Applied Science) tot 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS bij 42 ° C en voeg aan roller buis. Schroefdop op stevig en incubeer in roller oven op 42 ° C gedurende 60 minuten. Zorg ervoor dat de richting van de rol is van dien aard dat membraam niet vast. Controleer regelmatig op lekkage. </li><li> Was miniblotter in Pyroneg reinigingsmiddel en water, afspoelen en laten drogen. </li><li> Verwijder de membraan van roller tube. Was twee keer in de resterende 2xSSPE/0.5% SDS bij 42 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Was tweemaal in 2xSSPE bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Zet de oven tot 80 ° C en plaats 500 ml 1% SDS in de oven voor op pre-warm. </li><li> Make-up 15 ml Amersham ECL-detectie-oplossing (7,5 ml van oplossing A en 7,5 ml oplossing B). Gooi 2xSSPE en voeg detectie oplossing. Rock voorzichtig met de hand gedurende 2 minuten zorgen voor een volledige dekking van het membraan met de oplossing. Gooi chemiluminescentie oplossing. </li><li> Snij twee vellen plastic transparantie van de blootstelling cartridge te passen. Plaats membraan tussen de twee bladen en plaats van de blootstelling cartridge. </li><li> Ga verder naar de donkere kamer. Onder rood licht, voeg ECL-detectie film cartridge en bloot voor 5 minuten. Ezelsoor rechter benedenhoek van de film na verwijdering om de juiste richting laten bij het bekijken. </li><li> Ontwikkelen van film met automatische ontwikkelaar of chemische baden als richtingen per fabrikant. </li><li> Herhaalde blootstelling met een langere of kortere belichtingstijden indien nodig. </li></ol> 3. Regeneratie van Membraan <ol><li> Was membraan in 250 ml 1% SDS bij 80 ° C gedurende 30 minuten twee keer. </li><li> Was membraan in 240 ml 20 mM EDTA bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Seal membraan in een plastic zak met 10 ml 20 mM EDTA en de koelkast bij 4 ° C voor toekomstig hergebruik. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: De resultaten worden het best bekeken door het plaatsen van de film over een gedrukte rooster, of anders scannen van de afbeelding en het importeren in de software zoals BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België). Elke probe resultaat moet worden geïnterpreteerd aan de hand van positieve en negatieve controle probes. De resultaten zijn het best gesorteerd als negatief, zwak of positief. Positieve resultaten zijn waar het signaal zo sterk is als of sterker zijn dan de positieve controle probe. Negatieve resultaten zijn waar het signaal afwezig is of gelijk is aan de negatieve controle (in het geval van achtergrond signaal). Zwakke resultaten zijn waar het signaal is zwakker dan de positieve controle sonde, maar sterker dan de negatieve controle. Zwakke resultaten kan het gevolg zijn van punt mutaties die leiden tot zwakke probe binden, of door niet-specifieke signalen van primer dimeer vorming. Met behulp van twee sondes per doelwit van belang kan verbeteren met de specificiteit, waar een enkele zwakke resultaat veilig kan worden geïnterpreteerd als niet-specifiek signaal. Als er twijfel blijft bestaan, kan een enkel-complex PCR-reactie uitgevoerd worden met gel-gebaseerde detectie en de volgorde van iedere versterkerlified product om te bepalen of het resultaat is echt positief. Een vertegenwoordiger resultaat is weergegeven in figuur 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. MPCR / RLB principes (P1) Stap 1.9. Amine gewijzigd sondes zijn covalent gebonden aan een nylon membraan. (P2) Stap 2,10. Biotine gewijzigde PCR-producten worden gehybridiseerd met de sondes. (P3) Stap 2,14. Streptavidine, gelabeld met peroxidase, wordt geïncubeerd met het membraan en bindt aan biotine. (P4) Steps 2,19-2,21. Peroxidase katalyseert een reactie in de ECL-detectie reagentia, het produceren van licht tot die lichtgevoelige film wordt blootgesteld. Het membraan is dan gewassen voor hergebruik. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Vertegenwoordiger mPCR / RLB resultaat. Monsters 1 tot en met 6 geven positieve controles - tussen hen is er ten minste een positieve probe signaal voor elk van de 43 sondes. Elke doelsequentie (A tot en met U) wordt gedetecteerd met twee verschillende sondes om de specificiteit te maximaliseren. Probes A1 en A2 vertegenwoordigen species-specifieke probes, die naar verwachting positief zijn voor elk monster en met oriëntatie van de film te helpen. Probe A1 wordt herhaald op de bodem van het membraan. Monsters 7 en 8 zijn negatieve controles. Merk op dat Probes Q1, Q2, T1 en T2 signaal in de negatieve controles hebben, wat aangeeft waarschijnlijk niet-specifieke binding van primers of primer dimeer product. Re-design van deze probes of primers nodig zou zijn. Probes C1, D1 en F1 tonen strepen over het membraan waarschijnlijk te wijten aan een aantal niet-specifieke opname van het streptavidine-peroxidase conjugaat of chemiluminescent substraat, maar dit is gemakkelijk te onderscheiden van echt positief sonde signalen. Probes D1 en D2 hebben een relatief zwak signaal in vergelijking met andere sondes, kan dit te wijten zijn aan een grotere amplicons leidt tot minder efficiënte versterking. Probe J2 is negatief is meerdere monsters (1, 3, 4, 6, 39), waar probe J1 is positief. Deze meest waarschijnlijk is een mutatie in de J2 bindingsplaats voor deze monsters.

<ol>
	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay.">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li><li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium,+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization.">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li><li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li><li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li><li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses.">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species.">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li><li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens.">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li><li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay.">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis.">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li><li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De mPCR / RLB methode maakt gelijktijdige detectie van een groot aantal van de PCR-amplicons. Door de hoge gevoeligheid van chemiluminescent probe-gebaseerde detectie, kan een enkele multiplex-PCR reactie met grote aantallen primerparen worden gebruikt om de DNA-template te versterken. Als er geen sonde signalen worden verkregen met een of meer monsters, het uitvoeren van gel elektroforese met de resterende PCR-product kan u helpen te onderscheiden of het probleem is met de PCR-amplificatie of probe hybridisatie. Waar alle probe signalen op het membraan zijn zwak of afwezig, maar gelelektroforese geeft aan een succesvolle PCR-amplificatie, mogelijkheden zijn problemen met de etikettering van het membraan, onjuiste regeneratie van het membraan na eerdere gebruik, onjuiste temperaturen tijdens de hybridisatie of streptavidine incubatie, of defecte streptavidine- peroxidaseconjugaat of detectie reagens. Als controlemonsters aan te geven dat de individuele probes kunnen worden produceren van vals negatieve signalen, single PCR met gel-gebaseerde detectie en de daarop volgende volgorde kunnen worden uitgevoerd om versterking van het PCR-product te controleren en om voor sequentievariatie blik op de sonde bindingsplaats. Zwak of afwezig probe signaal kan te wijten zijn aan grote amplicongrootte: indien mogelijk, alle amplicons moeten ongeveer dezelfde lengte en minder dan 300 bp. Secundaire DNA-structuren van amplicons kunnen produceren ook een slechte sonde binding, en kan re-design van primers noodzakelijk. Individuele primer of probe concentraties kunnen ook worden gevarieerd om de signaalsterkte te optimaliseren. Vals positieve signalen als gevolg van probe binding van nonamplified primers of primer-dimeer product kan worden onderzocht door het uitvoeren van een PCR met gel-gebaseerde detectie en de daaropvolgende sequencing. Als dit gebeurt, herontwerp van de probes kunnen worden noodzakelijk. Puntmutaties in probe bindingsplaatsen kan leiden tot zwak of afwezig zijn signalen. Het toestaan ​​van twee sondes voor elk geamplificeerd product maakt dit gemakkelijk op te sporen. Deze eigenschap kan worden benut met een zorgvuldige primer en probe design tot kleine variaties in de volgorde target-DNA te detecteren. Kortom, terwijl er vele methoden van detectie-product volgende multiplex PCR-reacties beschikbaar, mPCR / RLB heeft het voordeel dat high-throughput en goedkoop met lage setup-kosten. De flexibiliteit van de methode maakt het gebruik ervan in voor een breed scala aan toepassingen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 5 &#39;amine C6 gewijzigd oligonucleotide probes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M oplossing gemaakt tot pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M oplossing </td></tr><tr><td> 20xSSPE buffer </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make-up 10% voorraadoplossing, geen autoclaaf, moet worden bewaard gedurende maximaal 1 week vóór het gebruik </td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Make-up 0,5 M oplossing pH 8,0 en de autoclaaf </td></tr><tr><td> N-(3-dimethylaminopropyl)-N &quot;-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Verzin een 20 ml 16% oplossing vlak voor gebruik met behulp van 3,2 g EDAC en 18 ml Millipore water </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 pm nylonmembraan 20x20 cm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Gedeïoniseerd, gezuiverd water </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vloeibaar wasmiddel Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-peroxidase conjugaat </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detectie reagentia </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detectie reagentia </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Transparency film </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Ijs </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Consumables gebruikt in de mPCR / RLB test. <table border="1"><tbody><tr><th> Uitrusting </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Ovens (2) rollende fles en nylon mesh scheiden </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Methode kan worden uitgevoerd met een oven, zolang er is mogelijkheid voor het handhaven van oplossingen bij 42 ° C en 60 ° C vóór gebruik </td></tr><tr><td> De Belly Dancer rockende platform </td><td> Stovall life science </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Waterbad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zuiging </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kookplaat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Blootstelling cartridge </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray film ontwikkelaar </td><td></td><td></td><td> Kan ontwikkelaar, fixeer en water ook gebruiken in trays in de donkere kamer in plaats van geautomatiseerdeontwikkelaar. Lumino-imager kan ook worden gebruikt in plaats van Xray film </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Vereiste apparatuur voor de mPCR / RLB test.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Line Blot hybridisatie assay maakt de detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten in 43 monsters met behulp van een multiplex-PCR reactie, gevolgd door probe hybridisatie op een nylon membraan, dat is herbruikbaar. Sondes zijn 5 &#39;amine aangepast om fixatie op het membraan mogelijk te maken. Primers zijn 5 &#39;biotine gewijzigd, die de detectie van gehybridiseerde PCR-producten met behulp van streptavidine-peroxidase en een chemiluminescent substraat via lichtgevoelige film maakt. Met een lage instelling en verbruiksartikelen kosten, deze techniek is goedkoop (ongeveer US $ 2 per sample), high throughput (meerdere membranen kunnen gelijktijdig worden verwerkt) en heeft een korte doorlooptijd (ca. 10 uur). De techniek kan worden gebruikt op een aantal manieren. Meerdere probes kunnen worden ontworpen om sequentievariatie detecteren binnen een geamplificeerd product of meerdere producten tegelijkertijd kunnen worden versterkt, met een (of meer) probes gebruikt voor de volgende detectie. Een combinatie van beide benaderingen kan ook gebruikt worden binnen een enkele assay. De mogelijkheid om meerdere sondes voor een enkele doelsequentie zijn maakt de test zeer specifiek. Gepubliceerd op toepassingen van mPCR / RLB zijn detectie van antibiotica resistentie genen 1,2, typering van methicilline-resistente Staphylococcus aureus 3-5 en Salmonella sp 6, moleculaire serotypering van Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 en enterovirussen 10,11, identificatie van Mycobacterium sp 12, detectie van genitale 13-15 en luchtwegen 16 en 17 andere ziekteverwekkers en detectie en identificatie van mollicuten 18. Echter, de veelzijdigheid van de techniek betekent dat de toepassingen zijn vrijwel onbeperkt en niet beperkt tot moleculaire analyse van micro-organismen. De vijf stappen in mPCR / RLB zijn a) Primer en Probe design, b), DNA-extractie en PCR-amplificatie c) Bereiding van het membraan, d) Hybridisatie en detectie, en e), regeneratie van het membraan.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Een goedkope, high throughput methode voor gelijktijdige detectie van maximaal 43 moleculaire doelwitten wordt beschreven. Toepassingen van mPCR / RLB onder andere micro-organismen te typen en de detectie van meerdere pathogenen uit klinische monsters.

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cellulaire toxiciteit van Nanogenomedicine in MCF-7 cellijn: MTT-test

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Snelle PCR thermocycling met Microscale Thermal Convectie

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...