Name: multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

מתיו או &#39;סאליבן ואת פיי ג&#39;ואו הם מקבלי האוסטרלית הלאומית לבריאות המועצה למחקר רפואי לתארים מתקדמים מלגות למחקר רפואי.

בחינה קפדנית חייב להינתן פריימר ועיצוב החללית. רצפים זמין כל היעדים של עניין ממסדי נתונים כגון GenBank צריך להיות מנוצל כדי לזהות אזורים שמורים אשר הם מטרות מתאימות. איפה מספר רב של מטרות נמצאים מוגבר ב assay mPCR יחיד, כל רצף מוגבר צריכה להיות באורך דומה, לא יעלה על 300 זוגות בסיסים, כדי למנוע תחרות. יישום החלופה של השיטה היא כדי להגביר עוד יעד אחד באמצעות primers נגד אזורים שימור להשתמש בדיקות מרובות כדי לזהות וריאציה רצף בתוך amplicon. במקרה זה, המוצר מוגבר PCR עשוי להיות ארוך יותר. הטמפרטורות פריימר חישול צריכים להיות דומים, עם תנאים PCR בהתאם. Primers המהווים מבנה משני חזקה או דימר פריימר יש להימנע. סיגמא אולדריץ DNA מחשבון ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) ניתן להשתמש כדי לנבא תכונות אלה. בדיקות ה-DNA צריך להיות מתוכנן להיות חישול בטמפרטורה קרובה ל -60 ° C. כדי למקסם את סגוליות, שתי חלליות עבור מטרה כל העניין ניתן לכלול assay, אחד והכלאה על גדיל ה-DNA קדימה סמוך לאתר פריימר הפוך מחייב, והשני גדיל הפוכה סמוך לאתר פריימר קדימה מחייב. במקרה זה, הן primers קדימה חייבת להיות הפוכה ביוטין, שונה. אם רק אחד בדיקה לכל מטרה מוגבר נמצא בשימוש, אז רק אחד פריימר צריך להיות ביוטין שונה. בעת תכנון primers ו בדיקות עבור assay mPCR / RLB מומלץ בחום להשתמש בשיטות סיליקו לחזות מוצרי ה-PCR ו הכלאה בדיקה כדי לתאם עם בתוצאות חוץ גופית. באופן אידיאלי זה נעשה באמצעות מבודד עבורו את רצף הגנום כולו זמין. תוכנות כגון FastPCR (זמין ב http://primerdigital.com/fastpcr.html) יכול לשמש למטרה זו. אות בדיקה חלש או נעדר ניתן לחזות היכן בניתוח סיליקו מציין זוג בסיס חוסר התאמה וכתוצאה מכך הטמפרטורות בדיקה נמוך חישול. טכניקות DNA מיצוי ישתנו בהתאם דגימות נבדקות, ותנאי PCR יהיה תלוי בעיצוב פריימר. הקוראים מתייחסים לפרסומים על מבחני הפרט לקבל מידע נוסף לגבי מיצוי דנ&quot;א ריאגנטים PCR ותנאי 1-19. Assay כל לרוץ עם בקרה נאותים כדי לספק לפחות אחת חיובית ואחת שלילית אות בדיקה עבור כל בדיקה על הממברנה, וכן דנ&quot;א ללא שליטה. כמו כן הוא מועיל לכלול בדיקה בחלק העליון של קרום זה צפוי להיות חיובי עבור כל דגימות (למשל: מין או בדיקה ספציפית הסוג במקרה של מיקרו אורגניזם). בדיקה זו משמשת שליטה חיובית, אלא גם מאפשר התמצאות קלה של התוצאות. 1. הכנת ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל NaHCO3 0.5m (pH 8.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל NaHCO 3 0.5m </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;ל 16% EDAC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 0.1 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 2xSSPE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% - מקום waterbath ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 20 mM EDTA. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים תנור ל 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את Miniblotter Immunetics עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את בדיקות oligonucleotide ב 0.5 M NaHCO 3 עד ריכוז סופי של pmol 2 / μl ואת נפח של μl 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קרום ניילון BiodyneC עד 15x15 ס&quot;מ. בעזרת עיפרון שליט, כלל את חלל 0.5 ס&quot;מ לרוחב החלק העליון של קרום ולכתוב פרטים כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום חותם בתוך שקית ניילון עם 20 מ&quot;ל טרי עשה פתרון EDAC 16% ו רוק בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים deionised קרום למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום ב miniblotter עם ערוצי פועל על פני קרום (במקביל לקו עיפרון). שימי כרית תמיכה במקומו הסופג קרוב. לשאוב נוזל מתוך ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי נתיבים 1 ו 45 עם 150 μl 0.5 M NaHCO 3. השתמש 150 μl של כל פתרון בדיקה למלא נתיבי 2-44 ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. אם בועת אוויר מופיע בערוץ, שמירה על פיפטה במקום, במהירות לשאוב את הפתרון כדי לאפשר את בועת אוויר לצוף לראש פיפטה, ולאחר מכן נסה שוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרונות בדיקה, להסיר ולשטוף בתוך קרום 250 מ&quot;ל 0.1 M NaOH בטמפרטורת החדר למשך 9 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום ב 250 מ&quot;ל 2xSSPE למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום ב 250 מ&quot;ל מראש חימם SDS 2xSSPE/0.1% בתנור ב 60 ° C במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא בשימוש הכלאה מיד, לשטוף את הממברנה של 240 מ&quot;ל 20 mM EDTA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות (שומר 10 מ&quot;ל הנותרים), ואז לאטום קרום בתוך שקית פלסטיק עם שאר 10 מ&quot;ל 20 mM EDTA ו storדואר במקרר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם miniblotter Pyroneg חומר ניקוי במברשת. לשטוף ולאפשר לו להתייבש. </li></ol> 2. הכלאת איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% - חנות באמבט מים ב 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות באמבט מים ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות בתנור ב 42 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל 2xSSPE - לשמור בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל 1% SDS - חנות באמבט מים ב 60 ° C בתחילה (עבור שלב 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 20 mM EDTA - לאחסן בטמפרטורת החדר (עבור שלב 3). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תנור אחד בכל 60 ° C ואחד תנור ל 42 ° C. מרתיחים את המים בכוס גדולה על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה Immunetics Miniblotter עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 10 מ&quot;ל של SDS 2xSSPE/0.1% לתוך מיכל קטן. הוסף 20 μl של כל מוצר ה-PCR ל 150% SDS 2xSSPE/0.1 μl צינורות ספורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים מוצרים PCR עבור 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס באמצעות בעלי קלקר. מניחים על קרח מיד לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום הנותרים ב 240 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% ב 60 ° C בתנור במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום ב miniblotter עם כרית גיבוי. כדי להתמצא ערוצי לרוץ במאונך (בניצב קו עיפרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עודף יניקה נוזל ערוצי miniblotter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הנותרים 150 SDS 2xSSPE/0.1% μl לערוצים הראשונה והאחרונה. הוסף מבושל מוצרים PCR לערוצים הנותרים (2-44) ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום miniblotter שטוח 60 ° C בתנור במשך שעה 1 כדי לאפשר הכלאה להתקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל לשאוב מערוץ אחד ולאחר מכן להסיר קרום מן miniblotter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים prewarmed 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלח רשת ניילון עם הפרדה SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהשתמש בו כדי להפשיל הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מגולגל הממברנה לתוך צינור גלגלת, ואת לפרוש כדי להבטיח קרום abuts את פני השטח הפנימי. הוסף 3 μl המצומד streptavidin-peroxidase (Roche Applied Science) על 15 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהוסיף צינור הרים. בורג מכסה על בחוזקה דגירה בתנור רולר על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. ודא כיוון רול הוא כזה קרום לא להדק. בדוק מעת לעת דליפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף miniblotter ב Pyroneg דטרגנט ומים, לשטוף ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת קרום מהצינור הרים. לשטוף פעמיים הנותרים 2xSSPE/0.5% SDS על 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים 2xSSPE בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התנור עד 80 מעלות צלזיוס, במקום 1% SDS 500ml בתנור חם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפרים 15 מ&quot;ל Amersham פתרון ECL זיהוי (7.5 מ&quot;ל של תמיסת A ו 7.5 מ&quot;ל של תמיסת B). בטל 2xSSPE ולהוסיף פתרון זיהוי. רוק בעדינות ביד במשך 2 דקות להבטיח כיסוי מלא של הממברנה עם פתרון. בטל פתרון chemiluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שתי יריעות של ניילון שקיפות כדי להתאים מחסנית חשיפה. המקום קרום בין שני סדינים במקום לתוך מחסנית חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך אל החושך. תחת אור אדום, להוסיף סרט זיהוי ECL למחסנית ולחשוף במשך 5 דקות. כלב באוזן ימין בפינה התחתונה של הסרט עם הסרת לאפשר בכיוון הנכון בעת ​​הצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרט פתח עם מפתח אוטומטיות או אמבטיות כימיים כמו יצרן לכל הכיוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על החשיפה פעמים עם חשיפה ארוך או קצר אם נדרש. </li></ol> 3. התחדשות של ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 250 מ&quot;ל ב SDS 1% ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 240 מ&quot;ל ב 20 מ&quot;מ EDTA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם קרום בשקית פלסטיק עם 10 מ&quot;ל 20 mM EDTA ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש מחדש בעתיד. </li></ol> 4. נציג תוצאות: התוצאות הן הנצפים ביותר על ידי הצבת את הסרט על הרשת מודפס, או אחר סריקת תמונה וייבוא ​​לתוך התוכנה כגון BioNumerics (יישומי מתמטיקה, Sint-מרטנס-Latem, בלגיה). התוצאה בכל בדיקה יש לפרש תוך התייחסות בדיקות בקרה חיוביים ושליליים. התוצאות מדורגות כמיטב שלילי או חיובי חלש. תוצאות חיוביות שבו האות חזק כמו או יותר חזק לחקור את השליטה חיובית. תוצאות שליליות הן שם האות נעדר או שווה לשלוט השלילי (במקרה של אות הרקע). תוצאות חלשות הם שבו האות חלש יותר מאשר לחקור את השליטה חיובי, אבל חזק יותר שליטה שלילית. תוצאות חלש עשוי להיות תוצאה של מוטציות נקודה המוביל מחייב בדיקה חלש, או בשל אי - ספציפי אותות היווצרות dimer פריימר. באמצעות שתי בדיקות לכל יעד הריבית יכולה לשפר את הספציפיות, שם תוצאה חלשה יחיד יכול בבטחה להתפרש האות הלא ספציפית. אם נותר ספק כלשהו, ​​תגובה אחת Plex PCR ניתן לבצע עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף של המגבר כלlified מוצר כדי לקבוע אם התוצאה היא חיובית באמת. התוצאה נציג מוצג באיור 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. איור mPCR / RLB עקרונות (P1) שלב 1.9. אמין בדיקות שונה קשורים קוולנטית אל קרום ניילון. (P2) שלב 2.10. ביוטין שונה מוצרים PCR הם הכלאה של בדיקות. (P3) שלב 2.14. Streptavidin, שכותרתו עם peroxidase, הוא מודגרות עם הקרום ונקשר ביוטין. (P4) שלבים 2.19-2.21. Peroxidase catalyses תגובה של ריאגנטים זיהוי ECL, ייצור אור שבה הסרט רגיש לאור חשוף. הממברנה נשטף אז לשימוש חוזר. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. MPCR נציג / RLB התוצאה. דוגמאות 1 עד 6 לייצג שולטת חיובית - ביניהם יש אחד לפחות אות בדיקה חיובית עבור כל אחד 43 בדיקות. כל רצף היעד (באמצעות U) מזוהה עם שתי בדיקות שונות על מנת למקסם את סגוליות. בדיקות A1 ו-A2 לייצג מינים ספציפיים בדיקות אשר צפויים להיות חיוביים עבור כל דגימה ולסייע עם המכוונת את הסרט. בדיקה A1 חוזר בחלק התחתון של הממברנה. דוגמאות 7 ו -8 הם שולטת שלילית. שים לב, בדיקות Q1, Q2, T1 ו-T2 יש אות שולטת שלילי, המעיד על הכריכה ספציפי סביר של primers או דימר המוצר פריימר. עיצוב מחדש של אלו בדיקות או primers יהיה צורך. בדיקות C1, D1 ולהראות F1 נמרח על פני קרום הנראה בשל ספיגת הלא ספציפית כמה המצומד streptavidin-peroxidase או המצע chemiluminescent, אולם זה נכון להבחין בקלות בין אותות בדיקה חיובית. בדיקות D1 ו-D2 יש אות חלש יחסית לעומת בדיקות אחרות, זה יכול להיות בגלל amplicons גדול המוביל הגברה פחות יעיל. בדיקה J2 הוא שלילי הוא מספר דוגמאות (1, 3, 4, 6, 39) שבו חללית J1 היא חיובית. זה ככל הנראה מייצג מוטציה מחייב האתר J2 עבור דגימות אלה.

<ol>
	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay.">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li><li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium,+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization.">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li><li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li><li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li><li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses.">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species.">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li><li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens.">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li><li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay.">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis.">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li><li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה mPCR / RLB היתרי זיהוי סימולטני של מספר רב של amplicons PCR. בשל הרגישות הגבוהה של בדיקה לגילוי מבוססי chemiluminescent, זמנית יחיד PCR תגובה עם מספר גדול של זוגות פריימר יכול לשמש כדי להגביר את תבנית ה-DNA. אם לא מתקבלים אותות בדיקה עם אחד או יותר דגימות, ביצוע אלקטרופורזה בג&#39;ל עם מוצר ה-PCR הנותרים יכולה לסייע להבחין אם הבעיה היא עם הגברה PCR או הכלאה בדיקה. איפה כל אותות בדיקה על הממברנה חלשים או נעדרים, אבל ג&#39;ל אלקטרופורזה מציין מוצלח הגברה PCR, האפשרויות כוללות בעיות עם תיוג של הממברנה, התחדשות שגוי של קרום לאחר השימוש הקודם, טמפרטורות נכונות במהלך הדגירה הכלאה או streptavidin, או פגום streptavidin- peroxidase המצומד או מגיב לגילוי. אם דגימות בקרת עולה כי בדיקות בודדים ניתן לייצר אותות שלילי כוזב, PCR יחיד עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף הבאות ניתן לבצע כדי לוודא הגברה של מוצר ה-PCR ולחפש וריאציה רצף באתר מחייב בדיקה. אות בדיקה חלש או נעדר יכול להיות בגלל גודל amplicon גדול: אם אפשר amplicons כל צריך להיות באורך דומה פחות מ -300 נ&quot;ב. מבנה ה-DNA משני של amplicons יכול גם לייצר מחייב בדיקה עני, ועלול להצריך עיצוב מחדש של ספרי לימוד. פריימר בודדת או ריכוזי בדיקה עשוי גם להיות מגוונות כדי לייעל את עוצמת האות. אותות חיוביים False בשל מחייב בדיקה של primers nonamplified או פריימר-dimer המוצר יכול להיחקר על ידי ביצוע PCR יחיד עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף הבאים. במקרה זה, עיצוב מחדש של בדיקות ניתן חייבה. מוטציות נקודתיות באתרים מחייב בדיקה עלולה להוביל אותות חלשים או נעדרים. מתן שתי בדיקות עבור כל מוצר מוגבר עושה את זה קל לזהות. מאפיין זה עשוי להיות מנוצל עם פריימר זהיר ועיצוב בדיקה כדי לזהות שינויים קטנים ב-DNA רצף היעד. לסיכום, בעוד ישנן שיטות רבות של זיהוי המוצר הבא תגובה זמנית PCR זמין, mPCR / RLB יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה וזול, עם עלויות התקנה נמוכות. הגמישות של השיטה היתרי השימוש בו למגוון רחב של יישומים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> אמין 5 &quot;C6 שונה בדיקות oligonucleotide </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S-8875 </td><td> 0.5 פתרון M עשה עד pH 8.4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S5881 </td><td> 0.1M פתרון </td></tr><tr><td> 20xSSPE חיץ </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodecyl נתרן סולפט (SDS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L-4390 </td><td> להמציא פתרון המניה 10%, לא החיטוי, יש לשמור על מקסימום 1 שבוע לפני השימוש </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E9884 </td><td> מאפרים 0.5 פתרון M מותאם pH 8.0 ו החיטוי </td></tr><tr><td> N-(3-Dimethylaminopropyl)-N &#39;ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDAC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7750 </td><td> להמציא פתרון 20 מ&quot;ל 16% רק לפני השימוש באמצעות EDAC 3.2 גרם ו 18 מ&quot;ל מים Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC ניילון 0.45 מיקרומטר ממברנה 20x20 ס&quot;מ </td><td> מל מדעי החיים </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionised, מים מטוהרים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pyroneg נוזלי ניקוי </td><td> ג&#39;ונסון Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-peroxidase המצומד </td><td> רוש </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL זיהוי ריאגנטים </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL זיהוי ריאגנטים </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> מטולשקפים הסרט שקיפות </td><td> חברות אקספרס </td><td> 504 EXP מטולשקפים </td><td></td></tr><tr><td> Amersham hyperfilm ECL ביצועים גבוהים chemiluminescent הסרט 18x24 ס&quot;מ </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> קרח </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. מתכלים המשמשים assay mPCR / RLB. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Shake&#39;n&#39;Stack תנורים Hybaid (2) בקבוק מתגלגל רשת ניילון המפריד </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> השיטה יכול להתבצע עם תנור אחד, כל עוד יש מתקן לשמירה על פתרונות 42 ° C ו 60 ° C לפני השימוש </td></tr><tr><td> רקדנית הבטן נדנדה פלטפורמה </td><td> Stovall מדעי החיים </td><td> יורו BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> המים באמבטיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> יניקה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חם בצלחת </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חשיפה מחסנית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> רנטגן הסרט מפתח </td><td></td><td></td><td> ניתן גם להשתמש, מפתחת מתקן מים במגשי בחדר חשוך במקום אוטומטיותמפתח. Lumino-imager עשוי לשמש גם במקום הסרט Xray </td></tr></tbody></table> 2. ציוד לוח הדרושים assay mPCR / RLB.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / קו הפוך כתם assay הכלאה מאפשרת זיהוי של עד 43 מטרות מולקולריות ב 43 דגימות באמצעות אחד ה-PCR זמנית תגובה ואחריו הכלאה בדיקה על קרום ניילון, אשר מחדש שמיש. בדיקות הן אמין &quot;5 שונה על מנת לאפשר קיבוע על הממברנה. Primers הם ביוטין 5 &quot;שונה המאפשר זיהוי של הכלאה מוצרים באמצעות PCR streptavidin-peroxidase ואת המצע chemiluminescent באמצעות סרט רגיש. עם ההתקנה עלויות נמוכות מתכלים, טכניקה זו היא זולה (כ 2 $ ארה&quot;ב לפי המדגם), קצב העברת נתונים גבוה (ממברנות מרובים יכול להיות מעובד בו זמנית) ויש לו זמן תגובה קצר (כ 10 שעות). הטכניקה ניתן להשתמש במספר דרכים. בדיקות מרובות ניתן נועד לזהות וריאציה רצף בתוך מוצר מוגבר אחד, או מספר רב של מוצרים יכול להיות מוגבר בעת ובעונה אחת, עם אחד (או יותר) בדיקות לגילוי שימוש לאחר מכן. השילוב של שתי הגישות יכול לשמש גם בתוך assay אחד. היכולת לכלול בדיקות מרובות רצף מטרה אחת עושה assay מאוד ספציפיות. פורסם יישומים של mPCR / RLB כוללים זיהוי של גנים 1,2 התנגדות לאנטיביוטיקה, הקלדה של סטפילוקוקוס עמידים-methicillin 3-5 ו סלמונלה sp 6, serotyping המולקולרי של Streptococcus pneumoniae 7,8, סטרפטוקוקוס agalactiae 9 ו enteroviruses 10,11, זיהוי של Mycobacterium sp 12, זיהוי של המין 13-15 ו - 16 בדרכי הנשימה ועוד 17 פתוגנים איתור וזיהוי של mollicutes 18. עם זאת, את צדדיות של הטכניקה אמצעי יישומים בלתי מוגבלות כמעט ולא מוגבלת ניתוח מולקולרית של מיקרואורגניזמים. חמשת השלבים mPCR / RLB הם פריימר) ועיצוב החללית, ב) מיצוי דנ&quot;א הגברה PCR ג) הכנת הממברנה, ד) הכלאת זיהוי, ו-e) התחדשות של הממברנה.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...