Name: multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Мэттью О `Салливан и Фэй Чжоу являются получателями Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета последипломного Стипендии медицинских исследований.

<ol>
	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay.">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li><li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium,+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization.">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li><li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li><li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li><li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses.">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species.">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li><li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens.">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li><li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay.">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis.">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li><li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

MPCR / RLB метод позволяет одновременное обнаружение большого количества ампликонов ПЦР. Из-за высокой чувствительности хемилюминесцентный зонд основе обнаружения, одной мультиплексной ПЦР реакция с большим количеством пар праймеров могут быть использованы для усиления ДНК. Если ни один датчик сигналов, полученных с одного или нескольких образцов, проведение гель-электрофореза с любой оставшийся продукт ПЦР может помочь отличить, является ли проблема с ПЦР-амплификации или зонда гибридизации. Там, где все сигналы датчика на мембране являются слабыми или отсутствуют, но гель-электрофореза указывает на успешное ПЦР-амплификации, возможности включают проблемы с маркировки мембрану, неправильной регенерации мембран после предыдущего использования, неправильной температуре во время инкубации гибридизации или стрептавидин, или дефектные стрептавидином сопряженных пероксидазы или обнаружения реагента. Если контрольные пробы показывают, что отдельные зонды может производить ложные отрицательные сигналы, один ПЦР с гелем основе выявления и последующего секвенирования могут быть выполнены, чтобы проверить усиления ПЦР-продукт и искать последовательность изменения в сайт связывания зонда. Слабый или отсутствующий датчик сигнала может быть связано с большим размером ампликона: если возможно все ампликонов должна быть такой же длины и менее 300 бп. Вторичные структуры ДНК ампликонов также может привести к плохой обязательным зонд и может привести к ре-дизайн праймеров. Индивидуальные грунтовки или зонд концентрации могут также быть изменены для оптимизации сигнала. Ложные положительные сигналы из-за связывания зонда nonamplified грунтовок или праймер-димеров продукт может быть исследована путем проведения ПЦР с одного на основе геля обнаружения и последующего секвенирования. Если это произойдет, редизайн зондов, которые могут потребоваться. Точечные мутации в сайтах связывания зонда может привести к слабой или отсутствия сигналов. Разрешение двух зондов для каждого продукта усиливается делает это легко обнаружить. Эта особенность может быть использована с тщательной грунтовки и зонда дизайн для обнаружения малых изменений последовательности ДНК-мишени. Таким образом, в то время как Есть много методов обнаружения следующих продуктов мультиплекс ПЦР доступны, mPCR / RLB имеет преимущество в том, высокую пропускную способность и недорогую установку с низким затрат. Гибкость метода позволяет использовать его в для широкого спектра применений.

<table border="1"><tbody><tr><th> Реагент </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> 5 &#39;амин C6 изменение олигонуклеотидных зондов </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 М раствор доводят до рН 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 М раствор </td></tr><tr><td> 20xSSPE буфер </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Додецилсульфата натрия (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Составляют 10% маточного раствора, не автоклав, должны храниться в течение 1 недели максимальная перед использованием </td></tr><tr><td> Этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Макияж 0,5 М раствор доводят до рН 8,0 и автоклава </td></tr><tr><td> N-(3-диметиламинопропил)-N &#39;-этилкарбодиимида (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Макияж 20 мл 16% раствора непосредственно перед использованием использованием EDAC 3,2 г и 18 мл воды Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 мкм нейлона Мембрана 20x20 см </td><td> PALL наук о жизни </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Деионизированная, вода очищенная </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Жидкие моющие средства Pyroneg </td><td> Джонсон Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Стрептавидин-пероксидазы сопряженным </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL обнаружения реагентов </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL обнаружения реагентов </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Прозрачная пленка </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 ОНР </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hyperfilm ECL высокую производительность хемилюминесцентный фильм 18х24 см </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Лед </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Расходные материалы, используемые в mPCR / RLB анализа. <table border="1"><tbody><tr><th> Оборудование </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Hybaid Печи Shake&#39;n&#39;Stack (2) прокатка бутылку и нейлона разделяющая сетка </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Метод может быть выполнена с одной печью тех пор, пока есть средство для поддержания растворов при 42 ° С и 60 ° С до использования </td></tr><tr><td> Качалка Belly Dancer платформы </td><td> Стовалл науки о жизни </td><td> Евро BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Водяная баня </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Всасывающий </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Электрическая плита </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Выдержки картридж </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Рентгеновской пленки разработчика </td><td></td><td></td><td> Можно также использовать разработчик, фиксажа и воды в лотки в темной комнате, а не автоматизированнаяразработчик. Lumino-тепловизор может также быть использован вместо фильма Xray </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Оборудование, необходимое для mPCR / RLB анализа.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Мультиплекс ПЦР / Обратная линия блот гибридизация анализа позволяет обнаруживать до 43 молекулярных мишеней в 43 образцах с помощью одной мультиплексной ПЦР реакции следуют зонда гибридизации на нейлоновую мембрану, которая повторного использования. Зонды 5 &#39;амин изменена, чтобы фиксации мембраны. Грунтовки 5 &#39;биотин изменение, которое позволяет обнаружения гибридизированных продуктов ПЦР с использованием стрептавидин-пероксидазы и хемилюминесцентный субстрат с помощью светочувствительной пленке. При низкой установки и затраты на расходные материалы, эта технология является недорогой (около 2 долл. США в выборке), высокая пропускная способность (несколько мембраны могут быть обработаны одновременно) и короткие сроки выполнения работ (около 10 часов). Метод может быть использован в ряде направлений. Несколько зонды могут быть предназначены для обнаружения последовательности изменения в пределах одного усиленный продукт, или несколько продуктов могут быть усилены одновременно, с одним (или более) зонды используются для последующего обнаружения. Сочетание обоих подходов также может быть использован в рамках одного теста. Возможность включать несколько зондов для одной последовательности целевой делает анализ весьма специфичны. Опубликованные приложения mPCR / RLB обнаружения включают антибиотик 1,2 генов устойчивости, введя метициллин-резистентный золотистый стафилококк 3-5 и Salmonella SP 6, молекулярной серотипирование Пневмококк 7,8, Streptococcus agalactiae 9 и энтеровирусы 10,11, идентификация микобактерий SP 12, выявление половых 13-15 и дыхательных путей 16 и 17 другими патогенами и обнаружения и идентификации mollicutes 18. Тем не менее, универсальность средств технического применения практически безграничны и не ограничивается молекулярного анализа микроорганизмов. Пять шагов в mPCR / RLB являются: а) Primer и зонда дизайн, б) выделения ДНК и ПЦР-амплификации с) подготовка мембраны, г) Гибридизация и обнаружения, и д) Регенерация мембраны.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Недорогие, высокая пропускная способность метода для одновременного обнаружения до 43 молекулярных мишеней описано. Применение mPCR / RLB включают набрав микробного и обнаружение нескольких возбудителей из клинических образцов.

Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Сотовая Токсичность Nanogenomedicine в MCF-7, клеточная линия: МТТ анализа

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Быстрые ПЦР термоциклирования использованием Микромасштабные тепловой конвекции

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

ДНК-микрочипов: Контроль качества образцов, Array Гибридизация и сканирования

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Анализ LINE-1 ретротранспозиции на уровне одного ядра

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Абсолютная количественная оценка уровня микроРНК в плазме у обезьян Cynomolgus, используя количественные реального времени обратной транскрипции PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...