Name: in vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells
Uploaded: 2011-05-16T14:00:00
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Lavoro nei laboratori degli autori è sostenuto da finanziamenti della scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, gli Istituti di Canada Health Research, e il Canada Research Chairs programma. JL è sostenuto da una borsa di studio dal Groupe d&#39;Étude des Membranaires Protéines (GEPROM) attraverso i finanziamenti del Fonds de Recherche en Santè du Québec.

1. Preliminare: ceppi batterici e le cellule epiteliali. Manipolazioni di cellule e batteri vengono eseguite in modo asettico, sotto una cappa a flusso laminare. <ol><li> Appena isolare la E. coli 2787, 2787Δ Aida, e C600 dalle scorte glicerolo in brodo lisogenia (LB) piastre di agar (1 triptone%, cloruro di sodio allo 0,5%, estratto di lievito 0,5%, 1,5% agar) e crescono a 37 ° C. Per minimizzare la variabilità nel test, si consiglia di utilizzare sempre ceppi appena ...

<ol>
	<li>Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesins+in+host-microbe+interactions.">Bacterial adhesins in host-microbe interactions.</a> Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).</li><li>Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+microbiology+emerging.">Cellular microbiology emerging.</a> Science. 271, 315-315 (1996).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).</li><li>Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).</li><li>Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+an+adhesin+(AIDA-I)+involved+in+diffuse+adherence+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).</li><li>Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+processing+is+not+essential+for+multiple+functions+of+the+Escherichia+coli+autotransporter+adhesin+involved+in+diffuse+adherence+(AIDA-I).">Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I).</a> J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).</li><li>Jacques, M., Paradis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesin-receptor+interactions+in+Pasteurellaceae.">Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae.</a> FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).</li><li>Auger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae+with+porcine+lung+and+tracheal+epithelial+cells.">Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells.</a> Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).</li><li>Jacques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipo-oligosaccharides+and+lipopolysaccharides+in+bacterial+adherence.">Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence.</a> Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).</li><li>Nataro, J. P., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarrheagenic+Escherichia+coli.">Diarrheagenic Escherichia coli.</a> Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).</li><li>Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+clinical+isolates+of+diarrhoeogenic+Escherichia+coli:+diffusely+adhering+E.+coli+strains+with+multiple+adhesive+factors.">Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors.</a> Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).</li></ol>

Questo protocollo descrive un dosaggio standard di aderenza dei batteri che possono essere modificati per studiare l&#39;invasione (ad esempio usando gentamicina saggio di protezione 3). Il conteggio delle unità formanti colonie consente la quantificazione, a confronto con approcci affidamento su tecniche di visualizzazione standard di sotto un microscopio, come la colorazione Giemsa. Quest&#39;ultimo fornisce una visione qualitativa di adesione, ma spesso è un complemento utile dal momento che può differe...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Alta glucosio DMEM </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 12430-054 </td></tr><tr><td> DDPBS </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> Crescita siero bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH3054 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> GIBCO-Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> 24 tavole ben </td><td> Corning </td><td> 3337 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151-100 </td></tr></tbody></table>

in vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells

A causare infezioni, i batteri devono colonizzare il loro ospite. Batteri patogeni esprimere varie molecole o strutture in grado di promuovere l&#39;attaccamento alle cellule ospite 1. Queste adesine si basano su interazioni con i recettori della cellula ospite superficie o proteine ​​solubili che funge da ponte tra batteri e ospite. L&#39;adesione è un primo passo fondamentale prima di invasione e / o secrezione di tossine, perciò è un evento chiave per essere studiato nella patogenesi batterica. Inoltre, i batteri aderito spesso squisitamente indurre risposte cellulari messo a punto, gli studi che hanno dato vita al campo di 2 &#39;microbiologia cellulare&#39;. Test robusti per l&#39;adesione batterica su cellule ospiti e la loro invasione quindi giocare un ruolo chiave negli studi di patogenesi dei batteri e sono da tempo utilizzati in molti laboratori pioniere 3,4. Questi test sono ora praticata dalla maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica. Qui, descriviamo un test standard di aderenza che illustrano il contributo di uno specifico adesina. Utilizziamo il ceppo di Escherichia coli 2787 5, un ceppo patogeno umano che esprime la autotransporter Adhesin Coinvolto in aderenza diffusa (AIDA). Come controllo, si utilizza un ceppo mutante privi del gene aida, 2787Δ Aida (F. e M. Berthiaume Mourez, inedito), e un ceppo di laboratorio commerciale di E. coli, C600 (New England Biolabs). I batteri sono lasciati di aderire alle cellule dal comunemente usati HEp-2 linea di cellule epiteliali umane. Questo test è stato meno ampiamente descritto in precedenza 6.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Questo protocollo è un test semplice adesione batterica che consiste nel contare il numero di unità formanti colonie batteriche che vengano rispettate su cellule in coltura. Il test è robusto, indipendente dal adesina studiato, e numerose varianti vengono utilizzate nella maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica.

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