Name: quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Frau Monika Tocchi für redaktionelle Durchsicht des Manuskripts danken. AMH wird durch ein Stipendium von King Abdulaziz Universität unterstützt wird, durch den saudi-arabischen Kulturbüro in Kanada.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Geräte <ol><li> Vor Beginn der Slot-Blot-Verfahren, bereiten 20_mls 4M Harnstoff-Lösung in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) für die Hämagglutinin-oder HA, Slot-Blot-oder 20_mls einer 0,01% Zwittergent Lösung in TBS für die Neuraminidase-oder NA, Slot-Blot. Während 4M Harnstoff jedes Mal frisch zubereitet werden sollte, ist eine 10% ige Zwittergent Stammlösung in dH 2 O für mindestens 6 Monate bei Raumtemperatur stabil und ka...

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	<li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+influenza+virus.">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li><li>Wood, J. 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X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. 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E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition.">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li><li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus.">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , (2010).</li></ol>

Quantitative Bestimmung des Influenza Virus HA und NA sind entscheidend für die Impfstoff-Forschung und Entwicklung, da diese beiden Oberflächenproteine ​​wichtigsten viralen Komponenten induzieren Immunreaktionen 6-11 sind. Zuvor berichtete immunologische Methoden zum Nachweis dieser Proteine ​​benötigen Belastung spezifischen Antikörpern. Die einfache, reproduzierbare und schnelle Slot-Blot-Methode, um die HA und NA-Antigenen hier beschriebenen Quantifizierung eignen sich für alle Influenza-A-V...

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Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes oder Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparatus </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Dot SF Filterpapier </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-FL Transfer-Membran (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Chemilumineszenz BioMax Light Film </td><td> Kodak </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem Gel-Dokumentations-System </td><td> Alpha Innotech </td><td> 29 bis 008-1896X </td><td></td></tr><tr><td> Universal-Kaninchen-Antikörper gegen HA und NA-Antigenen </td><td></td><td> Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) </td><td> Antikörper sind durch MTA erhältlich oder können von interessierten Forschern nach den Verfahren zuvor beschriebenen 6,7 erzeugt werden. </td></tr><tr><td> Influenza-Impfstoff-Antigen Referenz </td><td> CBER / FDA oder NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Influenza-Impfstoff Proben </td><td></td><td></td><td> Häufig in den meisten Ländern </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> Zwittergent 3-14 Waschmittel </td><td> Calbiochem </td><td> 693017 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker Non-Fett-Trockenmilch </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L), Peroxidase-konjugierten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal West Dura Erweiterte Duration Substrate </td><td> Thermo Scientific </td><td> 34075 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays

Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind zwei Oberflächenproteine ​​von Influenza-Viren, die bekanntlich eine wichtige Rolle im viralen Lebenszyklus und die Induktion von schützenden Immunantworten 1,2 zu spielen. Als Hauptzielgruppe für neutralisierende Antikörper, ist HA derzeit als das Influenza-Impfstoff Potenz Marker verwendet und wird durch einzelne radiale Immundiffusion (SRID) 3 gemessen. Allerdings verursacht die Abhängigkeit der SRID von der Verfügbarkeit der entsprechenden Subtyp-spezifischen Antiseren mindestens 2-3 Monate Verzögerung für die Veröffentlichung von jedem neuen Impfstoff. Darüber hinaus, obwohl es Belege, dass die NA auch induziert eine schützende Immunität 4, die Höhe der NA in Influenza-Impfstoffen ist noch nicht standardisiert durch einen Mangel an geeigneten Reagenzien oder analytische Methode 5. So sind einfache Alternative Methoden in der Lage Quantifizierung HA und NA-Antigenen wünschenswert für die schnelle Freigabe und bessere Qualitätskontrolle von Influenza-Impfstoffen. Universell konservierten Regionen in allen verfügbaren Influenza-A-HA und NA-Sequenzen wurden von einer leistungsfähigen Bioinformatik-Analysen 6-7 identifiziert. Eine Sequenz (bezeichnet als Uni-1) wurde in die einzige universell konservierte Epitop des HA, das Fusionspeptid 6 identifiziert, während zwei konservierte Sequenzen in Neuraminidasen, einer in der Nähe der enzymatisch aktiven Stelle (bezeichnet als HCA-2) und die identifiziert wurden, andere in der Nähe des N-Terminus (bezeichnet als HCA-3) 7. Peptide mit dieser Aminosäure-Sequenzen wurden synthetisiert und verwendet, um Kaninchen für die Produktion von Antikörpern zu immunisieren. Der Antikörper gegen das Uni-1-Epitop von HA konnte auf 13 Subtypen von Influenza-A-HA (H1-H13) zu binden, während die Antikörper gegen die HCA-2 und HCA-3-Regionen von NA wurden binden alle 9 NA-Subtypen. Alle Antikörper zeigten bemerkenswerte Spezifität gegen die viralen Sequenzen als durch die Beobachtung, dass keine Kreuzreaktivität zu Allantois Proteine ​​erkannt wurde nachgewiesen. Diese universellen Antikörper wurden dann verwendet, um Slot-Blot-Assays zu entwickeln, HA und NA in Influenza-A-Impfstoffe ohne die Notwendigkeit für spezifische Antiseren 7,8 quantifizieren. Vaccine Proben wurden auf eine PVDF-Membran mit einer Slot-Blot-Apparatur mit Referenzstandards verdünnt, um verschiedenen Konzentrationen angewendet. Für den Nachweis von HA, wurden die Proben und Standard-First in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 4M Harnstoff, während für die Messung von NA sie in TBS verdünnt wurden mit 0,01% Zwittergent diese Bedingungen deutlich verbessert die Nachweisempfindlichkeit. Nach der Erkennung des HA und NA-Antigenen durch Immunoblot mit ihren jeweiligen universellen Antikörper wurden Signalintensitäten durch Densitometrie quantifiziert. Mengen von HA und NA in den Impfstoffen wurden dann anhand einer Standardkurve mit den Signalintensitäten der verschiedenen Konzentrationen der Referenzen verwendet etabliert. Da diese Antikörper binden an universellen Epitope in HA oder NA konnten sich Interessierte Forscher sie als Werkzeuge der Forschung Verwendung in Immunoassays andere als die Slot-Blot nur.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

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Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

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Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

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Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...