Name: quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לגברת מוניקה Tocchi לבדיקה העריכה של כתב היד. AMH הוא נתמך על ידי מלגה מהמלך Abdulaziz University, דרך סעודיה תרבות הלשכה בקנדה.

1. הכנה של ריאגנטים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את ההליך כתם חריץ, להכין 20_mls של פתרון אוריאה 4M ב-טריס בופר סליין (20 mM טריס, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS) עבור hemagglutinin, או ארכיאולוגיות, כתם חריץ, או 20_mls של 0.01% Zwittergent פתרון TBS עבור neuraminidase, או NA, כתם ח...

<ol>
	<li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+influenza+virus.">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li><li>Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+host+cell+on+standardisation+of+influenza+vaccine+potency.">The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency.</a> Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).</li><li>Sylte, M. J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+as+a+vaccine+antigen.">Influenza neuraminidase as a vaccine antigen.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).</li><li>Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+meeting+on+the+role+of+neuraminidase+in+inducing+protective+immunity+against+influenza+infection.">WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection.</a> Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).</li><li>Chun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+and+their+applications+to+the+quantitative+determination+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins.">Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins.</a> Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).</li><li>Gravel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analyses+of+virtually+all+subtypes+of+influenza+A+and+B+viral+neuraminidases+using+antibodies+targeting+the+universally+conserved+sequences.">Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences.</a> Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+slot+blot+for+the+detection+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins+using+universal+antibodies+targeting+the+fusion+peptide.">A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide.</a> Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).</li><li>Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+haemagglutinin+in+H5N1+influenza+viruses+reveals+low+haemagglutinin+content+of+vaccine+virus+NIBRG-14+(H5N1).">Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1).</a> Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+deglycosylation+and+electrophoresis+to+the+quantification+of+influenza+viral+hemagglutinins+facilitating+the+production+of+2009+pandemic+influenza+(H1N1)+vaccines+at+multiple+manufacturing+sites+in+China.">Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China.</a> Biologicals. 38, 284-289 (2010).</li><li>Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition.">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li><li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus.">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , (2010).</li></ol>

קביעה כמותית של שפעת נגיפית HA ו NA הם קריטיים עבור מחקר ופיתוח החיסון שכן אלה שני חלבונים פני השטח הם מרכיבים נגיפיים החשוב ביותר גרימת התגובה החיסונית 6-11. שיטות אימונולוגיות דיווחו בעבר לצורך זיהוי של חלבונים אלה דורשים מאמץ נוגדנים ספציפיים. כתם פשוט, לשחזור מ...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Bio-Dot-SF Apparatus Microfiltration </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Dot-SF נייר סינון </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-FL העברת קרום (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> לשאוב אבק </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Chemiluminescence BioMax אור קולנוע </td><td> קודאק </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem ג&#39;ל מערכת תיעוד </td><td> אלפא Innotech </td><td> 29-008-1896X </td><td></td></tr><tr><td> ארנב נוגדנים נגד יוניברסל HA ו NA אנטיגנים </td><td></td><td> Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) </td><td> נוגדנים זמינים דרך MTA או יכול להיות שנוצר על ידי חוקרים מעוניינים פי הנהלים שתוארו לעיל 6,7. </td></tr><tr><td> התייחסות שפעת חיסון אנטיגן </td><td> CBER / או ה-FDA NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חיסון נגד שפעת דגימות </td><td></td><td></td><td> זמין בדרך כלל ברוב המדינות </td></tr><tr><td> דשן </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> דטרגנט Zwittergent 3-14 </td><td> Calbiochem </td><td> 693017 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> סופג חוסם כיתה ללא שומן יבש החלב </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure נגד ארנב עיזים IgG, (H + L), peroxidase מצומדות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal המערבית דורה Extended תשתית משך </td><td> Thermo Scientific </td><td> 34075 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays

Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם שני חלבונים פני השטח של נגיפי שפעת אשר ידועים תפקיד חשוב במחזור החיים ויראלי הגיוס של 1,2 התגובות מגן החיסון. כאשר המטרה העיקרית נוגדנים מנטרלים, HA משמש כיום גם את הסמן חיסון שפעת הפוטנציאל נמדדת immunodiffusion רדיאלי יחיד (SRID) 3. עם זאת, התלות של SRID על הזמינות של antisera המקביל תת ספציפיים הגורמים מינימום של 2-3 חודשים עיכוב לשחרורו של חיסון כל חדש. יתר על כן, למרות העדויות כי NA גם גורם החסינות 4, כמות NA בחיסונים לשפעת אינה סטנדרטית אך בשל חוסר של ריאגנטים המתאימים או שיטה אנליטית 5. לכן, שיטות חלופיות פשוט מסוגל לכימות אנטיגנים HA ו NA רצויות לשחרור מהיר, בקרת איכות טובה יותר של החיסונים לשפעת. אזורים שמורים אוניברסלי ב שפעת כולם זמינים HA ו NA רצפים זוהו על ידי מנתח ביואינפורמטיקה 6-7. אחת ברצף (יועד Uni-1) זוהה epitope רק את נשמרת אוניברסלית של HA, הפפטיד היתוך 6, בעוד שני רצפים שימור זוהו neuraminidases, אחד קרוב באתר הפעיל האנזימטית (יועד HCA-2) ואת קרובים אחרים הסופית-N (יועד HCA-3) 7. פפטידים אלו רצפים של חומצות אמיניות היו מסונתז ומשומשים לחסן ארנבות לייצור נוגדנים. נוגדנים נגד epitope Uni-1 של HA היה מסוגל להיקשר 13 subtypes של שפעת A HA (H1-H13) ואילו נוגדנים נגד HCA-2 ו HCA-3 אזורים של NA היו מסוגלים מחייב את כל 9 תת NA. כל הנוגדנים הראו סגוליות מדהים נגד רצפים ויראלי כפי שמעידים התצפית שלא לחצות תגובתיות לחלבונים allantoic זוהה. נוגדנים אלה אוניברסלי שימשו אז לפתח כתם מבחני חריץ לכמת HA ו NA של שפעת חיסונים ללא צורך antisera ספציפי 7,8. דגימות חיסון יושמו על קרום PVDF באמצעות מנגנון כתם חריץ יחד עם סטנדרטים התייחסות בדילול לריכוזים שונים. לצורך זיהוי של HA, דגימות תקן היו בדילול הראשון טריס שנאגרו מלוחים (TBS) המכיל אוריאה 4M בעוד למדידת NA הם מדולל TBS המכילה 0.01% Zwittergent התנאים האלה שיפרה בצורה משמעותית את רגישות הזיהוי. בעקבות גילוי של HA ו NA על ידי אנטיגנים immunoblotting עם נוגדנים אוניברסלי שלהם, בעוצמות האות היו לכמת ידי צפיפות. סכומי HA ו NA בחיסונים חושבו לאחר מכן באמצעות עקומת סטנדרט הוקמה עם עוצמות אות הריכוזים השונים של הפניות בשימוש. בהתחשב בכך נוגדנים אלה נקשרים epitopes אוניברסלי HA או NA, החוקרים מעוניינים יכול להשתמש בהם ככלי מחקר immunoassays מלבד כתם חריץ בלבד.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays at JoVE.com

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...