Name: quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00
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Los autores desean agradecer a la Sra. Monika Tocchi para la revisión editorial del manuscrito. AMH es apoyado por una beca de la Universidad King Abdulaziz, de Arabia Saudita a través de la Oficina Cultural de Canadá.

1. Preparación de los reactivos y equipos <ol><li> Antes de iniciar el procedimiento de slot blot, preparar 20_mls de solución de urea 4M en Tris-buffer salino (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) para la hemaglutinina o HA, slot blot, o 20_mls de un 0,01% Zwittergent solución de TBS de la neuraminidasa, o NA, slot blot. Mientras que la urea 4M debe estar preparado fresco todo el tiempo, una solución al 10% de acciones Zwittergent en dH 2 O es estable durante al menos 6 meses a temperatura ambiente y...

<ol>
	<li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+influenza+virus.">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li><li>Wood, J. 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X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+haemagglutinin+in+H5N1+influenza+viruses+reveals+low+haemagglutinin+content+of+vaccine+virus+NIBRG-14+(H5N1).">Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1).</a> Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+deglycosylation+and+electrophoresis+to+the+quantification+of+influenza+viral+hemagglutinins+facilitating+the+production+of+2009+pandemic+influenza+(H1N1)+vaccines+at+multiple+manufacturing+sites+in+China.">Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China.</a> Biologicals. 38, 284-289 (2010).</li><li>Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition.">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li><li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus.">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , (2010).</li></ol>

La determinación cuantitativa de la influenza viral HA y NA son críticos para la investigación y desarrollo de vacunas ya que estas dos proteínas de superficie son los componentes virales más importantes de inducir respuestas inmunes 06.11. Se informó anteriormente los métodos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra estas proteínas requieren cepa específica. El método de ranura mancha simple, reproducible y rápido para cuantificar los antígenos HA y NA aquí descritos son adecuados...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Bio-Dot SF aparato de microfiltración </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Dot SF filtro de papel </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-FL transferencia de membrana (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Quimioluminiscencia BioMax Cine Luz </td><td> Kodak </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem Gel Sistema de Documentación </td><td> Alpha Innotech </td><td> 29 a 008-1896X </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos de conejo contra la HA universales y los antígenos NA </td><td></td><td> Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) </td><td> Los anticuerpos están disponibles a través del MTA o pueden ser generados por los investigadores interesados ​​de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente 6,7. </td></tr><tr><td> Vacuna contra la influenza de referencia de antígenos </td><td> CBER / FDA o NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Muestras de vacunas contra la influenza </td><td></td><td></td><td> Comúnmente disponibles en la mayoría de los países </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> Zwittergent 3.14 Detergente </td><td> Calbiochem </td><td> 693017 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Secante bloqueador de grado bajo en grasa de leche en polvo </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure cabra anti-conejo IgG (H + L), conjugada con peroxidasa </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato </td><td> Thermo Scientific </td><td> 34075 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays

Hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son dos proteínas de superficie de los virus de influenza que se sabe que juegan un papel importante en el ciclo de vida viral y la inducción de respuestas inmunes protectoras 1,2. Como el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes, HA se utiliza actualmente como el marcador de potencia de la vacuna de la gripe y se mide por inmunodifusión radial simple (SRID) 3. Sin embargo, la dependencia del SRID de la disponibilidad de los antisueros correspondientes subtipos específicos de las causas de un mínimo de 2-3 meses de retraso para la liberación de todas las nuevas vacunas. Por otra parte, a pesar de la evidencia de que NA también induce inmunidad protectora 4, la cantidad de NA en vacunas de la gripe aún no está estandarizado debido a la falta de reactivos adecuados o métodos de análisis 5. Por lo tanto, simples métodos alternativos capaces de cuantificar los antígenos HA y NA son deseables para una liberación rápida y un mejor control de calidad de vacunas contra la influenza. Regiones universalmente conservadas en todos los de la gripe A disposición de HA y NA secuencias fueron identificados por análisis de la bioinformática 6-7. Una secuencia (designado como Uni-1) fue identificado en el epítopo sólo universalmente conservadas de la HA, el péptido de fusión 6, mientras que dos secuencias conservadas fueron identificados en neuraminidasa, una cerca del sitio activo enzimático (designado como HCA-2) y el otra cerca de la N-terminal (designado como HCA-3) 7. Péptidos con estas secuencias de aminoácidos fueron sintetizados y utilizados para inmunizar a los conejos para la producción de anticuerpos. El anticuerpo contra el epítopo Uni-1 de HA fue capaz de obligar a 13 subtipos de influenza A-HA (H1-H13), mientras que los anticuerpos contra el HCA-2 y HCA-3 regiones de NA fueron capaces de unirse a los 9 subtipos de NA. Todos los anticuerpos mostraron especificidad notable contra las secuencias virales como lo demuestra la observación de que sin reactividad cruzada con las proteínas alantoideo fue detectado. Estos anticuerpos universales fueron utilizados para desarrollar los ensayos de slot blot para cuantificar la HA y NA de la gripe A vacunas sin la necesidad de antisueros específicos 7,8. Muestras de la vacuna se aplica en una membrana de PVDF utilizando un aparato de slot blot, junto con las normas de referencia diluido a diferentes concentraciones. Para la detección de HA, muestra y el patrón se diluye primero en Tris-buffer salino (TBS), que contiene urea 4M, mientras que para la medición de NA que se diluyeron en TBS que contiene 0,01% Zwittergent ya que estas condiciones mejora significativamente la sensibilidad de detección. Tras la detección de los antígenos HA y NA por inmunotransferencia con sus respectivos anticuerpos universales, la intensidad de señal se cuantificaron por densitometría. Las cantidades de HA y NA de las vacunas fueron calculados utilizando una curva estándar establecida con la intensidad de la señal de las distintas concentraciones de las referencias utilizadas. Dado que estos anticuerpos se unen a epítopos universal en HA o NA, los investigadores interesados ​​puedan utilizarlos como herramientas de investigación en los inmunoensayos que no sea el slot blot solamente.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Un método sencillo slot blot fue desarrollado para la cuantificación de la hemaglutinina y la neuraminidasa viral de la gripe utilizando anticuerpos universales dirigidas a sus secuencias más conservadas identificados a través de análisis de la bioinformática. Este enfoque innovador puede ofrecer una alternativa útil para la determinación cuantitativa de todos los hemaglutinina y la neuraminidasa viral.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

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