Name: quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays at JoVE.com

Författarna vill tacka fru Monika Tocchi för redaktionell granskning av manuskriptet. AMH stöds av ett stipendium från King Abdulaziz universitet, genom den saudiarabiska kulturella Bureau i Kanada.

1. Beredning av reagens och utrustning <ol><li> Innan du börjar proceduren facket blot, förbereda 20_mls av 4M urealösning i Tris buffrad-saltlösning (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) för hemagglutinin, eller HA, slot blot eller 20_mls en 0,01% Zwittergent lösning i TBS för neuraminidas, eller NA, slot blot. Medan 4M urea bör beredas på nytt varje gång, är en 10% Zwittergent stamlösning i dH 2 O stabilt i minst 6 månader i rumstemperatur och kan därför spädas till 0,01% i TBS före var...

<ol>
	<li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+influenza+virus.">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li><li>Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+host+cell+on+standardisation+of+influenza+vaccine+potency.">The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency.</a> Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).</li><li>Sylte, M. J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+neuraminidase+as+a+vaccine+antigen.">Influenza neuraminidase as a vaccine antigen.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).</li><li>Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+meeting+on+the+role+of+neuraminidase+in+inducing+protective+immunity+against+influenza+infection.">WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection.</a> Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).</li><li>Chun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+and+their+applications+to+the+quantitative+determination+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins.">Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins.</a> Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).</li><li>Gravel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analyses+of+virtually+all+subtypes+of+influenza+A+and+B+viral+neuraminidases+using+antibodies+targeting+the+universally+conserved+sequences.">Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences.</a> Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+slot+blot+for+the+detection+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins+using+universal+antibodies+targeting+the+fusion+peptide.">A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide.</a> Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).</li><li>Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+haemagglutinin+in+H5N1+influenza+viruses+reveals+low+haemagglutinin+content+of+vaccine+virus+NIBRG-14+(H5N1).">Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1).</a> Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+deglycosylation+and+electrophoresis+to+the+quantification+of+influenza+viral+hemagglutinins+facilitating+the+production+of+2009+pandemic+influenza+(H1N1)+vaccines+at+multiple+manufacturing+sites+in+China.">Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China.</a> Biologicals. 38, 284-289 (2010).</li><li>Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition.">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li><li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus.">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , (2010).</li></ol>

Kvantitativ bestämning av influensa virus HA-och NA är kritiska för vaccin forskning och utveckling eftersom dessa två ytproteiner som är viktigast virala komponenter inducera immunsvar 6-11. Tidigare redovisade immunologiska metoder för detektion av dessa proteiner kräver stam specifika antikroppar. Den enkla, reproducerbar och snabb slot blot metod för att kvantifiera HA-och NA-antigen som beskrivs här är lämpliga för alla influensa A virus HA-och NA proteiner eftersom antikropparna känner igen...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn eller utrustning </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Bio-Dot SF Mikrofiltrering Apparater </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Dot SF Filtrerpapper </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-FL transfer membran (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumpump </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Kemiluminiscens Biomax Ljus Film </td><td> Kodak </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem Gel Dokumentationssystem </td><td> Alpha Innotech </td><td> 29-008-1896X </td><td></td></tr><tr><td> Universal kanin antikroppar mot HA-och NA-antigen </td><td></td><td> Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) </td><td> Antikroppar är tillgängliga via MTA eller kan genereras av intresserade utredare enligt de förfaranden som beskrivits tidigare 6,7. </td></tr><tr><td> Influensavaccin referens antigen </td><td> CBER / FDA eller NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Influensavaccin prover </td><td></td><td></td><td> Allmänt tillgängliga i de flesta länder </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> Zwittergent 3-14 Rengöringsmedel </td><td> Calbiochem </td><td> 693.017 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Blotting Grade Blocker Icke-fett torr mjölk </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure get-anti-kanin IgG, (H + L), Peroxidase konjugerad </td><td> Thermo Scientific </td><td> 31.460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal West Dura långvariga Substrat </td><td> Thermo Scientific </td><td> 34.075 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyses of all influenza type a viral hemagglutinins and neuraminidases using universal antibodies in simple slot blot assays

Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är två ytproteiner av influensavirus som är kända för att spela viktiga roller i virusets livscykel och induktion av skyddande immunsvar 1,2. Som det främsta målet för neutraliserande antikroppar är HA idag används som influensavaccin styrkan markör och mäts genom en enda radiell immunodiffusion (SRID) 3. Däremot orsakar beroende av SRID på tillgången på motsvarande subtyp-specifika antiserum minst 2-3 månader försening för frisläppandet av varje nytt vaccin. Dessutom, trots bevis på att NA också inducerar skyddande immunitet 4, mängden NA i influensavacciner är ännu inte standardiserad på grund av brist på lämpliga reagenser eller analytisk metod 5. Således enkla alternativa metoder som kan kvantifiera HA-och NA-antigen är önskvärda för snabb release och bättre kvalitetskontroll av influensavaccin. Universellt konserverade regioner i alla tillgängliga influensa A HA-och NA sekvenser identifierades av bioinformatik analyser 6-7. En sekvens (som betecknas som Uni-1) har identifierats i den enda universellt bevaras epitop av HA, fusion peptiden 6, medan två bevarade sekvenser identifierades neuroaminidaser, en nära den enzymatiska aktiva området (som betecknas som HCA-2) och andra nära den N-terminalen (som betecknas som HCA-3) 7. Peptider med dessa aminosyrasekvenser var syntetiseras och användas för att immunisera kaniner för produktion av antikroppar. Antikroppen mot Uni-1 epitopen av HA kunde binda till 13 subtyper av influensa A HA (H1-H13) medan antikroppar mot HCA-2 och HCA-3 regioner i NA var kan binda alla 9 NA-subtyper. Alla antikroppar visade anmärkningsvärd specificitet mot virala sekvenser vilket framgår av iakttagelse att ingen korsreaktivitet mot allantois proteiner upptäcktes. Dessa universella antikroppar används sedan för att utveckla analyser slot blot att kvantifiera HA-och NA i influensa A vaccin utan behov av särskilda antisera 7,8. Vaccin prover appliceras på en PVDF membran med hjälp av en apparat slot blot tillsammans med standardlösningar utspädd till olika koncentrationer. För detektering av HA, togs prover och standard first späds ut i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 4M urea samtidigt för mätning av NA: de var utspädd i TBS som innehåller 0,01% Zwittergent eftersom dessa tillstånd avsevärt förbättrat känslighet. Efter upptäckten av HA-och NA-antigen genom immunoblotting med sina respektive universella antikroppar, var signalen intensiteter kvantifieras av densitometri. Mängder av HA-och NA i vacciner sedan beräknas med hjälp av en standardkurva etablerats med den signal intensiteten hos olika koncentrationer av använda referenser. Med tanke på att dessa antikroppar binder till universella epitoper i HA eller NA, kan intresserade utredare använda dem som forskningsverktyg i immunoanalyser än facket blot bara.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays at JoVE.com

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

En enkel slot Blot-teknik har utvecklats för kvantifiering av influensa virus hemagglutinin och neuraminidas med universella antikroppar riktade sina mest bevarade sekvenser identifierats genom bioinformatik analyser. Detta innovativa tillvägagångssätt kan ge ett användbart alternativ till kvantitativ bestämning av alla virala hemagglutinin och neuraminidas.

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Virus för kvantifiering Viral funktion i alla skeden av genuttryck

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidig viralt inträde Analyser för identifiering och utvärdering av antivirala föreningarna

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyriserad glykan microarray analys för bedömning Aviditet och specificitet av influensa A-virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...