Name: generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av NIH i Grant R15 CA137499-01 (FB) och en start fond vid Ohio University (FB).

1. Dissektion av mus lårben och tibiae och kultur av benmärgsceller <ol><li> Offra två möss med CO 2 kvävning och noggrant dissekera skenben och lårben utan att skära benet slutar. </li><li> Rengör ben från alla anslutna vävnader med hjälp av silkespapper. Var noga med att inte bryta benen. </li><li> Sterilisera benen genom nedsänkning i 70% etanol i 10 min i en 35 mm petriskål. Från detta ögonblick, arbeta inuti en biosäkerhet huva för att undvika kontaminering av cellkulturer. </li><li> Återhämta benen från etanol och låt dem lufttorka i 5 minuter i en petriskål inuti biosäkerhet skåpet. </li><li> Skär lårben på mitten och skenbenet av dess tunnaste spets. Ingjuta insidan av benet med 1 ml RPMI medium (utan serum men med antibiotika) med hjälp av en steril spruta på en steril petriskål. </li><li> Cellsuspensionen samlas in och tvättas 2X i RPMI medium genom 10 min centrifugering i ett 15 ml centrifugrör vid 1100 rpm i en kyld centrifug (4 ° C) med en svängig hink rotor. </li><li> Efter den sista tvättningen, resuspendera cellerna i 2 ml ACK lyseringsbuffert och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur i syfte att eliminera röda blodkroppar. </li><li> Tillsätt 13 ml RPMI med 10% FBS, resuspendera och tvätta 2X i detta medium med samma inställningar som beskrivs i 1.6. </li><li> Räkna celler, justera till 2 x 10 5 celler / ml med RPMI 10% FBS och lägger RM-GM-CSF (20 ng / ml slutkoncentration) 5. </li><li> Tillsätt 10 ml av denna suspension till en steril, mikrobiologisk kvalitet, 10 cm petriskål och kultur i en CO 2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Tre dagar senare, lägga till ytterligare 10 ml RPMI 10% FBS med 20 ng / l rmgm-CSF till varje förberedda tallrikar. </li><li> Tre dagar senare 10 ml cellsuspension återvinns från varje petriskål, centrifugeras som i 1,6, suspenderade i samma volym RPMI 10% FBS med rmgm-CSF och återvände till petriskål. Cellerna odlas för 2 extra dagar i CO 2 inkubator. </li></ol> 2. Insamling och märkning av DCS <ol><li> Efter 8 dagar i kultur löst vidhäftande celler återvinns genom att tvätta de petriskålar med färska medium. Detta protokoll gör runt 2-4 x10 8 DCs i våra händer. Celler kan analyseras för DC-fenotyp med flödescytometri. </li><li> Insamlade cellerna då märkta med Qtracker 655 Cell Märkning Kit strikt efter tillverkarens anvisningar. </li><li> Vi fick mycket bra resultat märkning murin härledd från benmärg utvecklingsländerna med Qdots på en 10 nm koncentration. För att uppnå detta, A och B alikvoter av märkning Qtracker Cell Kit komponenter blandas i lika stora volymer, inkuberas i 5 minuter i rumstemperatur, och omedelbart utspädd 1 / 100 i färskt medium med vortexa i 30 s. </li><li> Att fläcken 5 x 10 6 DC, blanda 5 ìl av varje sats komponenter A och B i ett Eppendorf-rör och inkubera 5 min vid rumstemp. Lägg sedan till 1 ml RPMI 10% FBS inkubera och vortexa i 30 sekunder. </li><li> Tillsätt 0,5 ml cellsuspension innehåller 5 x10 6 utvecklingsländerna, och inkubera vid 37 ° C i 60 min. </li><li> Sedan tvätta cellerna 2X i RPMI 10% FBS (1100 RPM). Celler kan resuspenderas i RPMI för vidare kultur eller i PBS för injektion i experimentell möss. </li></ol> 3. Utvärdering av märkt DC <ol><li> Cell märkning kan utvärderas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. För att åstadkomma detta är en minskning med cellsuspension läggs till ett objektglas, täckt med ett glas täckglas, och utvärderas med ett fluorescerande mikroskop med hänsyn till att dessa Qdots har utsläpp och excitation spektra av 565nm och 405-525nm respektive (Fig. 3 ) </li><li> Vid denna punkt kan de märkta cellerna ska användas för injektion djur eller mognad kan induceras genom inkubering dessa celler i 48 timmar (37 ° C, 5 CO 2) i närvaro av LPS (100 ng / ml) och TNF-( 20 ng / ml). Fluorescerande märkningen påverkas inte av DC-mognad (bild 4). </li></ol> 4. Representativa resultat: Härmed har vi beskrivit hur man förbereder murina härledd från benmärg DC och hur märkt dem med fluorescerande Qdots. FIG. 1 sammanfattas förfarandet för att få celler, medan figur. 2 beskriver förfarandet för att märka dem med Qdots. Som visas i figur. 3, nästan alla celler är märkta på detta sätt, och detta påverkas inte av DC-mognad med inflammatoriska faktorer (bild 4). FIG. 5 visar att Qdot-färgade DCS (Fig.5a) beter sig snarlikt icke-färgade cellerna när de behandlas med en inflammatorisk cocktail. Både cell förberedelser upregulate liknande uttryck av co-stimulerande molekyler (bild 5b), och producerar liknande mängder av IL-6 (figur 5c) och kväveoxid (Fig. 5d) vid mognad stimuli. Detta överensstämmer med tidigareOU publicerade data indikerar att Qdot färgning påverkar inte förmågan att DC förvandlas till mogna celler kan framkalla immunsvar [6]. Dessa celler kan sedan användas för att injicera försöksdjur. Som visas i figur. 6, 2 dagar efter intravenös injektion av märkt DC på möss, kunde vi upptäcka Qdot färgade celler i mjälten. Detta är också överens med tidigare publicerade data som visar användningen av Qdot nanokristaller att utvärdera migration av DC in vivo [6] av icke-invasiv imaging och flödescytometri. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Flödesschema för DC generationen från benmärg. Härmed har vi skildra processen att få härledd från benmärg DC. Både skenben och lårben är dissekeras och rena från omgivande vävnad. Bone tips är bevarade och det inre av ben spolas med medium. Efter eliminering av röda blodkroppar, är benmärgsceller odlade under 8 dagar i närvaro av GM-CSF för att skilja dem i utvecklingsländer. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Flödesschema av märkningen förfarande. Lika alikvoter av märkning Qtracker Cell Kit komponenter A och B blandas i ett Eppendorf-rör. Dendritiska celler samlas in från 8-dagars kulturer benmärg med GM-CSF och blandas med märkning färgen i 60 minuter vid 37C. Då cellerna tvättas i media för att eliminera överskott märkning partiklar. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Lysrör microphotography av DCS omedelbart efter märkning. En droppe märkt celler deponeras på en glasplatta och täcks av ett täckglas. Därefter togs prover utvärderades i en fluorescensmikroskop och bilder har förvärvats genom en Micropublisher 5,0 digital CCD färgkamera (Qimaging, Surrey, BC Kanada). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Lysrör microphotography av DCS efter 48 timmar mognad in vitro. Märkta DCs odlades i 48 timmar med LPS (100 ng / ml) och TNF-α (20 ng / ml) på glas bilder på en CO 2-inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Därefter togs prover tvättas med PBS (5 min, 2X), fast med aceton (15 min, 4 ° C) och counterstained med DAPI. Celler utvärderades i ett fluorescerande mikroskop som ovan. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figur 5"/> Figur 5. Biologiska aktiviteten hos Qdot färgade mogna DC. Märkta DCs mognat in vitro som ovan analyserades med flödescytometri (A) och (B). (A) Qdot färgade celler ger en stark signal i FL3 (PercP) kanal. Skuggade histogram: ofärgade kontroll. (B) Qdot-färgade och ofärgade utvecklingsländerna har dessutom målat med specifika antikroppar mot mognad markörer CD86 och CD40, och kontroller isotyp. Celler har sedan analyserats i ett FACSort flödescytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dessutom var IL-6 (C) och kväveoxid (NO) bestäms i supernatanterna mogna Qdot färgade utvecklingsländerna och kontroller. Nivåer av IL-6 och kväveoxid bestämdes med hjälp av ELISA-analys och Griess analys som vi tidigare har beskrivit 7, 8. Alla data visade i denna siffra är representativ för två eller tre oberoende försök visar liknande resultat. Data analyserades med ANOVA med hjälp av GraphPad programvara. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figur 6"/> Figur 6. Detektion av märkta DCs i dissekeras vävnader. Märkta mogna DCS (1x10 6 celler) var intravenöst injiceras i C57BL / 6 möss. (A) Två dagar senare möss offrades och mjälte samlas in, snap frysta, inbäddade i oktober och 8 mikroM sektioner prepareras med en kryostat. Därefter togs prover fast med aceton (15 min, 4 ° C) och counterstained med DAPI. Celler utvärderades i ett fluorescerande mikroskop som ovan Fig. 6a:. 40X förstoring, Fig. 6b: 100x förstoring, bild. 6C, 400X förstoring.

<ol>
	<li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li><li>Bonasio, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+migration+and+function+of+circulating+dendritic+cells.">Generation, migration and function of circulating dendritic cells.</a> Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).</li><li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+instructive+role+of+dendritic+cells+on+T+cell+responses:+lineages,+plasticity+and+kinetics.">The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics.</a> Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).</li><li>Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-infiltrating+dendritic+cell+precursors+recruited+by+a+beta-defensin+contribute+to+vasculogenesis+under+the+influence+of+Vegf-A.">Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.</a> Nat Med. 10, 950-958 (2004).</li><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).</li><li>Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+near-infrared+fluorescent+semiconductor+nanocrystals.">Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals.</a> Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).</li><li>Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV+oncolytic+therapy+upregulates+interferon-inducible+chemokines+and+recruits+immune+effector+cells+in+ovarian+cancer.">HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer.</a> Mol Ther. 12, 789-802 (2005).</li><li>Gilboa, E., Vieweg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+with+mRNA-transfected+dendritic+cells.">Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells.</a> Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).</li><li>Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+murine+dendritic+cell+antitumor+dysfunction+in+aging.">Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging.</a> Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).</li><li>Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+infection+of+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells:+influence+on+antigen+presentation+and+initiating+an+immune+response.">Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).</li><li>Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+tumor+antigen+vaccination+using+dendritic+cells:+comparison+of+RNA+electroporation+and+pulsing+with+UV-irradiated+tumor+cells.">Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells.</a> J Transl Med. 6, 21-21 (2008).</li><li>Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+CD11c-DTR/GFP+mice+after+in+vivo+depletion+of+dendritic+cells.">Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells.</a> Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).</li><li>Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+support+angiogenesis+and+promote+lesion+growth+in+a+murine+model+of+endometriosis.">Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis.</a> Faseb J. 22, 522-529 (2008).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+dendritic+cells+and+atherosclerosis.">Vascular dendritic cells and atherosclerosis.</a> Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).</li><li>Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+augment+choroidal+neovascularization.">Dendritic cells augment choroidal neovascularization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).</li><li>Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+dendritic+cells+delays+ovarian+cancer+progression+by+boosting+antitumor+immunity.">Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity.</a> Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).</li><li>Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+peripheral+monocytes+express+endothelial+markers+and+in+the+presence+of+angiogenic+growth+factors+differentiate+into+endothelial-like+cells.">Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells.</a> Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).</li><li>Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+tumour-associated+dendritic+cells+into+endothelial-like+cells:+an+alternative+pathway+of+tumour+angiogenesis.">Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis.</a> Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions.">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques.">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li></ol>

Murina myeloisk) Utvecklingsländerna har i stor utsträckning använts för att fastställa effekt och förbättring av DC-baserade vacciner, undersöka DC: T-cell interaktioner eller DC utveckling, och bestämma deras roll i olika sjukdomar 9-11. Härmed visar vi hur du skapar utvecklingsländerna från prekursorer återhämtat sig från ben squash av skenben och lårben. Vi återhämta benen utan att skära av tips, tillåter oss att sterilisera dem genom nedsänkning i etanol 70%, vilket minskar sannolikheten för förorening. För att skilja DCs från benmärgsceller använder vi bara GM-CSF som tidigare beskrivits 5. Även om vissa protokoll också använda IL-4, har det rapporterats att detta cytokin är inte nödvändigt när man arbetar med höga halter av GM-CSF 12. I själva verket har vi visat tidigare att dessa DCs kan inducera immunsvar 13. Dessutom har vård vidtas för att återkräva bara löst vidhäftande celler från 8-dagars kulturer genom att tvätta de petriskålar med medium sedan fäst celler visar en mer monocyte-liknande fenotyp. Här visar vi märkning av utvecklingsländerna med fluorescerande Qdot partiklar. Denna märkning har vissa fördelar gentemot andra metoder. Först är de Qdots partiklar lätt införlivas i cellerna. För det andra är fluorescerande signal mycket hög och ändras inte av DC-mognad. För det tredje är fluorescensen inte förlorade när cellerna eller vävnaderna fixeras med lösningsmedel som aceton, i motsats till vad som händer om GFP används för att märka utvecklingsländerna 14, vilket ger mer flexibilitet för tillfället att välja färgning protokoll. Slutligen ger den höga fluorescerande signal som ges av dessa partiklar visualisering av celler trots vävnaden auto-fluorescens. Som tidigare beskrivits 6, gjorde Qdot färgning påverkar inte mognaden kapaciteten av dessa celler. Härmed visar vi att Qdot-färgade DCs beter sig på ett liknande sätt som icke-färgade utvecklingsländerna, upregulating co-stimulerande molekyler och producera IL-6 och kväveoxid som svar på inflammatoriska stimuli. Även Utvecklingsländerna celler specialiserade på att utlösa immunsvar, de har visat att delta i sjukdomstillstånd som cancer och åderförkalkning 4, 15, 16. De har också hävdat att delta i angiogena process 17, 18, ​​även föreslagits som strukturellt deltar i utvecklingen av nya fartyg 19, 20. Således metoder som möjliggör DC spåra in vivo, och bestämma deras geografiska lokalisering i olika vävnader 4, 21, 22 är mycket värdefulla.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 möss </td><td> Jackson laboratorier </td><td></td><td> Kvinnor, 6-8 veckor gamla </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovint serum, kvalificerad </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika-antimykotika </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK Lysing Buffer </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant murina GM-CSF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Cell Märkning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysackarid </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant mus TNF alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 antikropp </td><td> BD Biosciences </td><td> 553.791 </td><td></td></tr><tr><td> Griess reagenssystemet </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 fånga antikroppar </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 detektionsantikropp </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler (APC) som finns i perifera vävnader och i immunologiska organ såsom tymus, benmärg, mjälte, lymfkörtlar och Peyers plack 1-3. DCs som finns i perifera vävnader prov organismen för förekomsten av antigener, som de tar upp, bearbeta och presentera i sin yta i samband med större histocompatibility molekyler (MHC). Sedan antigen-loaded DC migrera till immunologiska organ där de presenterar de bearbetade antigenet för T-lymfocyter som utlöser specifika immunsvar. Ett sätt att utvärdera flyttande förmåga DCS är att märka dem med fluorescerande färger 4. Härmed har vi demonstrera användningen av Qdot fluorescerande nanokristaller att märka murina härledd från benmärg DC. Fördelen med denna märkning är att Qdot nanokristaller har stabila och långvariga fluorescens som gör dem idealiska för att upptäcka märkta celler i återhämtat vävnader. För att uppnå detta kommer först cellerna skall återkrävas från murina ben squash och odlade i 8 dagar i närvaro av granulocyt makrofag-kolonistimulerande faktor för att framkalla DC differentiering. Dessa celler ska sedan märkta med fluorescerande Qdots genom att korta in vitro inkubation. Färgade celler kan visualiseras med en fluorescerande mikroskopi. Celler kan injiceras i försöksdjuren vid denna punkt eller kan till mogna celler på in vitro inkubation med inflammatoriska stimuli. I våra händer gjorde DC mognad avgör inte förlust av fluorescerande signal heller Qdot färgning påverkar biologiska egenskaper av DCS. Efter injektionen, kan dessa celler identifieras i immun organ med fluorescerande mikroskop följande typiska dissektion och förfaranden fixering.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies at JoVE.com

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritiska celler upptag antigener och vandrar mot immun organ för att presentera behandlas antigen till T celler. Qdot nanocrystal märkningen ger en långvarig och stabil fluorescerande signal. Detta möjliggör spårning av dendritiska celler till olika organ med fluorescerande mikroskopi.

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cysta Wall Bildning i aktiverade härledd från benmärg makrofager och Bradyzoite Villkor

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Utredning av Makrofag Polarisering Använda benmärg makrofager

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

I vitro Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generation av omogna, mogna och tolerogena dendritiska celler med olika Metabolic fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Lårben Fönster Chamber modell för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Spårning i murina benmärgs

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...