Name: preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00
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1. Vorbereitung der Sylgard bedeckten Teller, experimentelle Kammern und Rasierklingen <ol><li> 35 mm Falcon Petrischalen mit Sylgard Elastomer beschichtet sind für die ordnungsgemäße Hacken eines isolierten Netzhaut auf einzelne Sehzellen erhalten benötigt. Das Elastomer wird nach den Anweisungen des Lieferanten und eine kleine Menge in jede Schale gegossen, um dessen Boden mit einer Schicht bedecken vorbereitet. Ersetzen Sie die Antenne deckt nach der Beschichtung und speichern sie. In ein paar Tagen wird das El...

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	<li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Counting+Photons:+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction.">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li><li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Photoreceptors.">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors.">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin.">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li><li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration:+The+Friedenwald+Lecture.">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li><li>Lamb, T. D., Pugh, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors.">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li><li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors.">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li><li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors.">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li><li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments.">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li><li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks.">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li><li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle:+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology.">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li><li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors.">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li><li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments.">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li><li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors.">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li><li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

Wenn gesunde isolierten Zellen nicht erhalten werden, liegt das Problem entweder mit der Isolierung oder der Gesundheit der Netzhaut oder mit ihren Hacken. In der Regel nach dem Entfernen der Vorderseite des Auges und der Glaskörper, die Netzhaut leicht hebt das Pigmentepithel. Wenn es nicht zu schälen versuchen Sie ausgehend von der Peripherie der Augenmuschel. Wenn es immer noch schwer zu trennen, ist eine wahrscheinliche Möglichkeit, dass das Tier wurde nicht dunkel-adaptierten für eine angemessene Zeit, oder das...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Dunklen Raum (100-150 m 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rote Ampeln 19 </td><td></td><td></td><td> Online-Shops </td></tr><tr><td> Infrarot-Lichtquellen und Infrarot-Bildbetrachter </td><td> FJW Optical Systems, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Präpariermikroskop 19 </td><td></td><td></td><td> Ausgestattet mit Infrarot-Zuschauer </td></tr><tr><td> Epifluoreszenzmikroskop in einem lichtdichten Käfig 19 umschlossen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissecting Werkzeuge (Scheren, Pinzetten, Messerhalter) </td><td> Roboz oder Fine Science Tools </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard Elastomer </td><td> Essex (Charlotte, NC) </td><td> Sylgard 184 Elastomer-Kit </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithin (0,01%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin (0,1%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920 </td><td> Verdünnen auf 0,01% </td></tr><tr><td> Experimentelle Kammern </td><td> Warner Instruments (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, Kunststoffpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

In der Retina ist Phototransduktion, die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, durch die Stäbchen und Zapfen Sehzellen 1-4 durchgeführt. Stäbchen-Photorezeptoren sind für das Sehen zuständig bei schwachem Licht, Kegel in helles Licht. Phototransduktion erfolgt in den äußeren Teil der Sehzellen, ein spezialisiertes Fach, dass eine hohe Konzentration von visuellen Pigment, das primäre Lichtdetektor enthält. Cis-Retinal, die an ein Protein, Opsin - Die visuelle Pigment besteht aus einem Chromophor, 11 zusammengesetzt. Ein Photon durch die visuelle Pigment absorbiert isomerisiert des Chromophors von 11 - cis zu all-trans. Diese Photoisomerisierung führt zu einer Konformationsänderung in die visuelle Pigment, das eine Kaskade von Reaktionen gipfelte in einer Änderung des Membranpotentials, und die Herbeiführung einer Transduktion der Lichtreiz in ein elektrisches Signal auslöst. Die Erholung der Zelle aus Licht Stimulation beinhaltet die Deaktivierung der Zwischenprodukte durch Licht aktiviert, und die Wiederherstellung des Membranpotentials. Ca 2 + moduliert die Aktivität von mehreren der Enzyme in Phototransduktion beteiligt, und seine Konzentration auf Licht Stimulation reduziert. Auf diese Weise Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in der Erholung der Zelle aus Licht Stimulation und seine Anpassung an Hintergrundlicht. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Recovery-Prozess ist die Regeneration der visuellen Pigment, während Licht-Erkennung wurde durch die Photoisomerisierung von seinen 11 zerstört - cis Chromophor all-trans 5-7. Diese Regeneration beginnt mit der Veröffentlichung von all-trans Retinal durch die photoaktivierte Pigment, hinterlässt der Apo-Protein Opsin. Die freigesetzten all-trans-Retinal wird schnell in eine Reaktion unter Verwendung von NADPH zu all-trans-Retinol und Opsin reduziert kombiniert mit frischen 11 - cis-Retinal in die äußere Segment der Sehpigment Reform gebracht. All-trans-Retinol wird dann aus dem äußeren Bereich und in den benachbarten Zellen, die durch den spezialisierten Träger Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) übertragen. Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Sehzellen kann verwendet werden, um ihre Physiologie und Zellbiologie studieren. Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, um im Detail zu untersuchen das Zusammenspiel zwischen äußeren Segment Ca 2 + Veränderungen und Antwort zu 8-12 sowie die Rolle der inneren Segment Ca 2 + Läden in Ca 2 +-Homöostase Licht 13,14 . Fluoreszierende Farbstoffe können auch zur Messung von Mg 2 +-Konzentration verwendet werden 15, pH-Wert und als Tracer von wässrigen und Membran Fächer 16. Schließlich kann die Eigenfluoreszenz von all-trans-Retinol (Vitamin A) verwendet werden, um die Kinetik der Bildung und Entfernung in einzelnen Sehzellen 17-19 überwachen.

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Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Oder anderen Faktoren.

Vorbereitung der Lebens-Isolated Vertebrate Sehzellen für Fluoreszenz-Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...