Name: preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

נתמך על ידי מענק ניי EY014850.

1. הכנת Sylgard צלחות מלאות, לתאי ניסוי, סכיני גילוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ&quot;מ פלקון צלחות פטרי מצופות אלסטומר Sylgard יש צורך לקצוץ התקין של הרשתית מבודד להשיג תאים photoreceptor יחיד. אלסטומר מוכן על פי הוראות הספק כמות קטנה הוא שפך לתוך כל מנה כדי ל...

<ol>
	<li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Counting+Photons:+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction.">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li><li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Photoreceptors.">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors.">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin.">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li><li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration:+The+Friedenwald+Lecture.">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li><li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision.">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li><li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Microscopy:+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision.">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2++in+Salamander+Rods.">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2++Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors.">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li><li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice.">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li><li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish.">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li><li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors.">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li><li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors.">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li><li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors.">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li><li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments.">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li><li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks.">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li><li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle:+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology.">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li><li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors.">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li><li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments.">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li><li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors.">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li><li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

אם מבודדים תאים בריאים לא מתקבלים, הבעיה נעוצה גם עם בידוד או לבריאות של הרשתית או עם הקיצוץ שלה. בדרך כלל, לאחר הסרת הקדמי של העין ואת הזגוגית, הרשתית בקלות מרים את אפיתל הפיגמנט. אם לא, לנסות לקלף אותו החל בפריפריה של עיינית. אם זה עדיין קשה להפריד, אפשרות סבירה היא כי ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> החדר האפל (100-150 רגל 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אורות אדומים 19 </td><td></td><td></td><td> חנויות מקוונות </td></tr><tr><td> מקורות אור אינפרא אדום לצופים תמונה אינפרא אדום </td><td> FJW Optical Systems, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ 19 </td><td></td><td></td><td> לבוש עם הצופים אינפרא אדום </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence סגורה בכלוב אור חזק 19 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלים לנתח (מספריים, מלקחיים, בעל להב) </td><td> Roboz או כלים המדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard אלסטומר </td><td> אסקס (שארלוט, NC) </td><td> Sylgard 184 אלסטומר ערכת </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine (0.01%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין (0.1%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8920 </td><td> מדולל ל% 0.01 </td></tr><tr><td> ניסיוני בתאי </td><td> וורנר מכשירים (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי, טפטפות פלסטיק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

ברשתית החוליות, phototransduction, ההמרה של האור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי מוט חרוט תאים photoreceptor 1-4. Photoreceptors רוד אחראים ראייה באור עמום, חרוטים על רקע בהיר. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני של התא photoreceptor, תא מיוחד המכיל ריכוז גבוה של פיגמנט ויזואלי, גלאי אור ראשוני. פיגמנט ויזואלי מורכב chromophore, 11 - ציס רשתית, מחובר לחלבון, opsin. פוטון נספג על ידי פיגמנט הראייה isomerizes chromophore מ 11 - ציס לכל, טרנס. Photoisomerization זה מביא לשינוי קונפורמציה פיגמנט הראייה כי יוזם מפל של תגובות שהגיעו לשיאן שינוי פוטנציאל הממברנה, ולהביא על התמרה של גירוי האור לאות חשמלי. ההתאוששות של התא מפני גירוי האור כולל את שחרור משרות של ביניים מופעל על ידי אור, ואת כינונה מחדש של פוטנציאל הממברנה. Ca 2 + מודולציה את הפעילות של כמה אנזימים המעורבים phototransduction, וריכוז שלה הוא מופחת על גירוי אור. בדרך זו, Ca 2 + משחק תפקיד חשוב בתהליך ההחלמה של התא מפני גירוי האור והתאמתה אור רקע. עוד חלק חיוני של תהליך ההחלמה הוא התחדשות של פיגמנט הראייה כי הושמד במהלך איתור לאור על ידי photoisomerization של 11 שלה - chromophore לכל cis-trans 5-7. התחדשות זה מתחיל עם שחרורו של טרנס כל הרשתית על ידי הפיגמנט photoactivated, והותיר אחריו opsin apo-החלבון. שוחררו כל טרנס רשתית מצטמצם במהירות התגובה לכל ניצול NADPH-טרנס רטינול, ו opsin משלב עם 11 טרי - רשתית cis להכניס קטע החיצוני לרפורמה פיגמנט הראייה. כל trans-רטינול הוא הועבר לאחר מכן מתוך קטע החיצוני לתוך תאים שכנים על ידי חלבון retinoid התמחה Interphotoreceptor המוביל הכבילה (IRBP). דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptor יחיד יכול לשמש כדי ללמוד הפיזיולוגיה שלהם ביולוגיה של התא. Ca 2 + רגיש צבעי ניאון ניתן להשתמש כדי לבחון בפירוט את יחסי הגומלין בין קטע החיצוני Ca 2 + שינויים בתגובה האור 8-12, כמו גם את תפקידו של פלח Ca פנימי 2 + חנויות Ca 2 + הומאוסטזיס 13,14 . צבעי ניאון יכול לשמש גם למדידת Mg 2 + בריכוז 15, רמת החומציות, וכן קליעים נותבים של מימיות קרום התאים 16. לבסוף, הקרינה הפנימית של כל טרנס רטינול (ויטמין A) ניתן להשתמש כדי לפקח על קינטיקה של הקמתו והסרת תאים photoreceptor יחיד 17-19.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; או גורמים אחרים.

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...