Name: preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Med stöd av NEI bidrag EY014850.

1. Beredning av Sylgard täckta rätter, experimentella kammare, och rakblad <ol><li> 35 mm Falcon petriskålar belagd med Sylgard elastomer behövs för en väl hugga av en isolerad näthinnan för att få samma ljusmätare celler. Den elastomer är upprättad enligt leverantörens anvisningar och en liten mängd hälls i varje rätt att täcka sina botten med ett lager. Sätt skålen täcker efter beläggning och lagra dem. Inom några dagar kommer den elastomer hårdnar och disken är klar. </li><li> Isolerade foto...

<ol>
	<li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Counting+Photons:+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction.">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li><li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Photoreceptors.">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors.">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin.">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li><li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration:+The+Friedenwald+Lecture.">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li><li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision.">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li><li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Microscopy:+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision.">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2++in+Salamander+Rods.">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2++Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors.">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li><li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice.">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li><li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish.">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li><li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors.">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li><li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors.">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li><li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors.">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li><li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments.">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li><li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks.">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li><li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle:+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology.">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li><li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors.">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li><li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments.">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li><li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors.">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li><li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

Om friska isolerade celler inte erhålls ligger problemet antingen med isolering eller hälsa i näthinnan eller dess hackning. Vanligtvis, efter bort framsidan av ögat och glaskroppen, lyfter näthinnan lätt bort pigmentepitel. Om inte, försök att skala bort det från och periferi ögonmusslan. Om det är fortfarande svårt att separera, är en trolig möjlighet att djuret inte har mörk anpassade för en lämplig tid, eller det röda ljuset är för ljust. Säkerställa korrekt mörk-anpassning för djuret, och d?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Mörkt rum (100-150 m 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rött ljus 19 </td><td></td><td></td><td> Nätbutiker </td></tr><tr><td> Infraröd ljuskällor och infraröd tittare bild </td><td> FJW Optical Systems, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Analysera mikroskop 19 </td><td></td><td></td><td> Utrustad med infraröd tittare </td></tr><tr><td> Epifluorescensmikroskop inneslutna i en ljus-tight bur 19 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Analysera verktyg (sax, pincett, kniv hållare) </td><td> Roboz eller Fin Verktyg Vetenskap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard elastomer </td><td> Essex (Charlotte, NC) </td><td> Sylgard 184 elastomer kit </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithine (0,01%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysin (0,1%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920 </td><td> Späd till 0,01% </td></tr><tr><td> Experimentella kammare </td><td> Warner instrument (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> Petriskålar, plastpipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

I ryggradsdjur näthinnan, är ljusöverledningen, omvandling av ljus till en elektrisk signal, som utförts av tappar och stavar ljusmätare celler 1-4. Rod fotoreceptorer är ansvariga för visionen i svagt ljus, koner i starkt ljus. Ljusöverledningen sker i den yttre delen av fotoreceptor cell, en specialiserad fack som innehåller en hög koncentration av visuella pigment, det primära ljuset detektorn. Den visuella pigment består av en kromofor, 11 - cis retinal, knutna till ett protein, opsin. En foton absorberas av visuella pigment isomerizes de kromofor från 11 - cis till all-trans. Detta photoisomerization medför en conformationaländring i den visuella pigment som initierar en kaskad av reaktioner som kulminerar i en förändring i membranpotential, och föra över transduktion av ljuset stimulans till en elektrisk signal. Återhämtningen i cellen från ljus stimulering innebär avaktivering av intermediärer aktiveras av ljus, och återupprättandet av membranet potential. Ca 2 + modulerar aktiviteten hos flera av de enzymer som är involverade i ljusöverledningen, och koncentrationen reduceras vid lätt stimulering. På detta sätt Ca 2 + spelar en viktig roll i återhämtningen i cellen från ljus stimulans och dess anpassning till bakgrundsbelysning. En annan viktig del av återvinningsprocessen är förnyelse av det visuella pigment som har förstörts under ljus-detektion av photoisomerization av dess 11 - cis kromofor till all-trans 5-7. Denna förnyelse börjar med lanseringen av all-trans-retinal av photoactivated pigment och lämnar bakom apo-protein opsin. Den släppt all-trans-retinal snabbt reduceras i en reaktion som använder NADPH till all-trans-retinol, och opsin kombinerar med färska 11 - cis retinal förs in i yttre segmentet för att reformera den visuella pigment. All-trans-retinol överförs sedan ut i den yttre segmentet och i angränsande celler genom att de specialiserade transportören Interphotoreceptor Retinoid bindande protein (IRBP). Fluorescens avbildning av enstaka fotoreceptor celler kan användas för att studera deras fysiologi och cellbiologi. Ca2 +-känsliga fluorescerande färger kan användas för att i detalj undersöka samspelet mellan yttre segmentet Ca 2 + förändringar och reaktion på ljus 8-12 samt den roll inre segment Ca 2 +-butiker i Ca 2 + homeostas 13,14 . Fluorescerande färger kan också användas för att mäta Mg 2 + koncentrationen 15, pH och som spårämnen i vattenlösning och fack membran 16. Slutligen kan den inneboende fluorescens av all-trans retinol (vitamin A) användas för att övervaka kinetiken av bolagsbildningen och borttagning i enstaka ljusmätare celler 17-19.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

En metod beskrivs för beredning av enskilda celler lever fotoreceptor från olika ryggradsdjur för fluorescens avbildning. Metoden kan användas för att avbilda fluorescens av endogena fluoroforer, såsom NADH eller vitamin A, eller som exogent lagt fluorescerande färger känslig för Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Eller andra faktorer.

Beredning av Living Isolerade Vertebrate ljusmätare celler för fluorescens avbildning

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

En isolerad näthinnan förberedelse till Record Ljus Svar från Genetiskt Märkta Retinal ganglion celler

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detektion av Microregional hypoxi i mus Cerebral Cortex med två-foton Imaging av endogen NADH fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

En isolerad Semi-intakt Beredning av Mouse Vestibular sensoriska epitelet för elektrofysiologi och Högupplöst Två-foton mikroskopi

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisering av endosome Dynamics i Living nervterminaler med Fyrdimensionell fluorescens avbildning

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sektione mus Retina man förbereder ljusmätare kulturer

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Millisekund väte / deuteriumutbyte masspektrometri för studier av alfa-synuklein strukturell dynamik under fysiologiska förhållanden

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...