Name: analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons at JoVE.com

Wij danken Kelly Jones voor een zorgvuldige bewerking. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01MH 071.316, Alzheimer&#39;s Association, de Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD), en de Nationale Alliantie voor Autisme Research (naar) (PP), American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de Amerikaanse Heart Association Predoctorale Fellowship (KMW).

Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om dendritische wervelkolom morfologie en dynamiek in een primaire gekweekte systeem te onderzoeken. 1. De voorbereiding van de primaire corticale neuron culturen <ol><li> Bereid high-density corticale neuron culturen uit Sprague-Dawley rat E18 embryo&#39;s en cultuur in gliacellen-geconditioneerde serum-vrij medium 1-2. </li><li> Euthanaseren een zwangere rat (E18) volgens ACUC procedures; snel te verwijderen baarmoeder (met foet...

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li><li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines.">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li><li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals.">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure.">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li><li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity.">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li><li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines.">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity.">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li><li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6.">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li><li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling.">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li><li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly.">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li></ol>

De hierboven beschreven technieken voor de gedetailleerde kwantitatieve analyse van dendritische wervelkolom morfologie, lineaire dichtheid en de beweeglijkheid in een van beide vaste of live primaire corticale neuronen zijn gericht op het begrijpen van de effecten van de post-synaptische mechanismen die kunnen bijdragen aan neuropathologieën. Een soortgelijke aanpak kan gebruikt worden om de wervelkolom morfologie of beweeglijkheid in een stekelige neuron, inclusief de hippocampus piramidale, Purkinje, of medium steke...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> 18 mm ronde Cover glas No 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm vierkante Cover glas No 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64 tot 0,721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Neurobasal Media </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Wetenschappelijke </td><td> ASC-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25 tot 060-C een </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Formaldehyde-oplossing </td><td> Merck Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologie graad </td></tr><tr><td> Normaal Geiten Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H + L) sterk cross-geadsorbeerde </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (H + L) * zeer cross-geadsorbeerd * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold antifade reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Speciale verpakking </td></tr><tr><td> Afgesloten beeldvorming stadium kamer </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuurregelaar unit </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons

Dendritische stekels zijn de websites van de meerderheid van prikkelende verbindingen in de hersenen, en vormen de post-synaptische compartiment van synapsen. Deze structuren zijn rijk aan actine en is aangetoond dat zeer dynamisch. In reactie op de klassieke Hebbian plasticiteit evenals neuromodulatory signalen, kan dendritische spines van vorm veranderen en het aantal, waarvan wordt gedacht kritisch te zijn voor de verfijning van neurale circuits en de verwerking en opslag van informatie in de hersenen. Binnen de dendritische spines, een complex netwerk van eiwitten koppelen extracellulaire signalen met het actine cyctoskeleton waardoor de controle van dendritische wervelkolom morfologie en nummer. Neuropathologische studies hebben aangetoond dat een aantal van de ziekte staten, variërend van schizofrenie tot autisme spectrum stoornissen, abnormale dendritische ruggegraat morfologie of cijfers weer te geven. Bovendien hebben recente genetische studies geïdentificeerd mutaties in tal van genen die eiwitten coderen synaptische, wat leidt tot suggesties dat deze eiwitten kunnen bijdragen aan afwijkende wervelkolom plasticiteit die voor een deel ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van deze aandoeningen. Met het oog op onderzoek naar de mogelijke rol van deze eiwitten in het controleren van dendritische wervelkolom morfologie / nummer, het gebruik van gekweekte corticale neuronen biedt verschillende voordelen. Ten eerste is dit systeem zorgt voor hoge-resolutie beeldvorming van dendritische spines in vaste cellen als time-lapse imaging van levende cellen. Ten tweede, dit in vitro systeem maakt een eenvoudige manipulatie van proteïne functie door de expressie van mutant eiwitten, knockdown door shRNA constructen, of farmacologische behandelingen. Deze technieken kunnen de onderzoekers om te beginnen met de rol van de ziekte-geassocieerde eiwitten ontleden en te voorspellen hoe de mutaties van deze eiwitten kunnen functioneren in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons at JoVE.com

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Het analyseren van dendrietmorfologie in Kolommen en Lagen

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...