Name: analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Kelly Jones für die sorgfältige Bearbeitung. American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS);; Diese Arbeit wurde vom NIH R01MH 071316, Alzheimer Association, der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) und die National Alliance for Autism Research (naar) (PP) unterstützt amerikanischen Heart Association Promotionsstipendium (KMW).

Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um dendritischen Dorn Morphologie und Dynamik in jeder primären kultivierten Systems zu untersuchen. 1. Vorbereitung der primären kortikalen Neuronen Kulturen <ol><li> Bereiten Sie High-Density-kortikalen Neuronen Kulturen aus Sprague-Dawley Ratten E18 Embryonen und Kultur in Glia-bedingten serum-freiem Medium 1-2. </li><li> Euthanize eine schwangere Ratte (E18) nach ACUC Verfahren; schnell zu entfernen Gebärmutter (mit F...

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li><li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines.">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li><li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals.">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure.">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li><li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity.">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li><li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines.">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity.">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li><li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6.">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li><li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling.">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li><li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly.">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li></ol>

Die oben beschriebenen Techniken für die detaillierte quantitative Analyse der dendritischen Dorn Morphologie, lineare Dichte und Beweglichkeit in fester oder leben primären kortikalen Neuronen sind auf das Verständnis der Auswirkungen der postsynaptischen Mechanismen, die zu Neuropathologien beitragen können konzentriert. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Wirbelsäule Morphologie und Motilität in allen stacheligen Neuron, einschließlich Hippocampus pyramidal, Purkinje, oder mittlere stachelige Neuro...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 18 mm rund Deckglas Nr. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm ² Deckglas Nr. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Neurobasal Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Scientific </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> MediaTech CellGro </td><td> 25 bis 060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Formaldehyd-Lösung </td><td> EMD Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologie grade </td></tr><tr><td> Normale Ziegen Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG (H + L) hochvernetzte adsorbiert </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) * hochvernetzte adsorbiert * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-Antifade Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Spezielle Verpackungen </td></tr><tr><td> Anbei Abbildungsstufe Kammer </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Temperature Controller-Einheit </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons

Dendritischen Dornen sind die Seiten der Mehrheit der exzitatorischen Verbindungen im Gehirn, und bilden die postsynaptischen Fach von Synapsen. Diese Strukturen sind reich an Aktin und haben gezeigt, dass eine hohe Dynamik. Aufgrund der klassischen Hebb&#39;sche Plastizität sowie neuromodulatorischen Signale können dendritischen Dornen in Form und Zahl, die vermutlich von entscheidender Bedeutung sein für die Veredelung von neuronalen Schaltkreisen und die Verarbeitung und Speicherung von Informationen im Gehirn ist. Innerhalb dendritischen Dornen, Link ein komplexes Netzwerk von Proteinen extrazelluläre Signale mit dem Aktin cyctoskeleton ermöglicht die Kontrolle von dendritischen Dorn Morphologie und Anzahl. Neuropathologische Studien haben gezeigt, dass eine Reihe von Erkrankungen, angefangen von Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen, abnorme dendritischen Dorn Morphologie oder Zahlen anzuzeigen. Darüber hinaus haben die jüngsten genetischen Studien Mutationen in zahlreichen Genen, die synaptischen Proteine ​​kodieren identifiziert, was für Vorschläge, dass diese Proteine ​​an aberranten Wirbelsäule Plastizität, die zum Teil unterliegen der Pathophysiologie dieser Erkrankungen beitragen können. Um die mögliche Rolle dieser Proteine ​​bei der Kontrolle der dendritischen Dorn Morphologien / Anzahl Studie bietet der Einsatz von kultivierten kortikalen Neuronen mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht dieses System für hochauflösende Bildgebung der dendritischen Dornen in fixierten Zellen sowie Zeitraffer-Imaging lebender Zellen. Zweitens ermöglicht diese in vitro-System für einfache Handhabung der Funktion des Proteins durch Expression von mutierten Proteinen, Knockdown von shRNA-Konstrukte oder medikamentöse Behandlungen. Diese Techniken können die Forscher damit beginnen, die Rolle der krankheits-assoziierte Proteine ​​zerlegen und vorherzusagen, wie Mutationen dieser Proteine ​​können in vivo-Funktion.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons at JoVE.com

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...