Name: analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00
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Ringraziamo Kelly Jones per l&#39;editing accurato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01MH 071316, l&#39;Alzheimer Association, l&#39;Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Schizofrenia e Depressione (NARSAD), e l&#39;Alleanza Nazionale per la Ricerca Autismo (NAAR) (PP); American Heart Association borsa di studio post-dottorato (DPS); americano Heart Association Fellowship Predoctoral (KMW).

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per esaminare la morfologia dendritica e la dinamica della colonna vertebrale in qualsiasi sistema primario colta. 1. Preparazione di colture primarie di neuroni corticali <ol><li> Preparare ad alta densità culture neuroni corticali di ratto Sprague-Dawley E18 embrioni e la cultura nelle cellule gliali condizionata mezzo privo di siero 1-2. </li><li> Euthanize un ratto in gravidanza (E18) in base alle procedure ACUC; rimuovere ...

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	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+neuronal+cell+culture.">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li><li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines.">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li><li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals.">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure.">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li><li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity.">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li><li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines.">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li><li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons:+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors.">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li><li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity.">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li><li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6.">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li><li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling.">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li><li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly.">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li></ol>

Le tecniche descritte sopra per la dettagliata analisi quantitativa della morfologia spine dendritiche, densità lineare e la motilità sia in neuroni primari fissa o vivere corticali sono focalizzati sulla comprensione degli effetti di post-sinaptico meccanismi che possono contribuire alla neuropatologie. Un approccio simile può essere utilizzato per quantificare la morfologia e la motilità della colonna vertebrale in qualsiasi neuroni spinosi, tra cui piramidali dell&#39;ippocampo, Purkinje, o neuroni spinosi di med...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 18 millimetri di copertura in vetro rotondo No. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 millimetri quadrati di copertura in vetro No. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Salita scientifico </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Soluzione di formaldeide </td><td> EMD chimici </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Istologia grado </td></tr><tr><td> Capre normale sierico </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson ImmunoResearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L), altamente cross-adsorbito </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L) * altamente cross-adsorbito * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Imballaggio speciale </td></tr><tr><td> In allegato l&#39;imaging camera di fase </td><td> Ammonitore </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Termoregolatore unità </td><td> Ammonitore </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universale Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of dendritic spine morphology in cultured cns neurons

Spine dendritiche sono i siti della maggior parte delle connessioni eccitatorie all&#39;interno del cervello, e la forma post-sinaptica vano di sinapsi. Queste strutture sono ricchi di actina e hanno dimostrato di essere altamente dinamica. In risposta alla classica plasticità Hebbian così come i segnali neuromodulatori, spine dendritiche possono cambiare forma e numero, che è pensato per essere critica per la raffinatezza dei circuiti neurali e della trasformazione e conservazione delle informazioni all&#39;interno del cervello. All&#39;interno di spine dendritiche, una complessa rete di proteine ​​collegamento segnali extracellulari con il cyctoskeleton actina permettendo il controllo della morfologia e il numero di spine dendritiche. Gli studi neuropatologici hanno dimostrato che un certo numero di stati patologici, che vanno dalla schizofrenia ai disturbi dello spettro autistico, display anomalie morfologiche dendritiche colonna vertebrale o numeri. Inoltre, recenti studi genetici hanno identificato mutazioni in numerosi geni che codificano proteine ​​sinaptiche, portando a suggestioni che queste proteine ​​possono contribuire alla plasticità della colonna vertebrale aberrante che, in parte, alla base della fisiopatologia di questi disturbi. Per studiare il potenziale ruolo di queste proteine ​​nel controllo delle morfologie spine dendritiche / numero, l&#39;uso di colture di neuroni corticali offre diversi vantaggi. In primo luogo, questo sistema permette di imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche in cellule fisse e time-lapse imaging di cellule vive. In secondo luogo, questo sistema in vitro permette una facile manipolazione della funzione della proteina da parte espressione di proteine ​​mutanti, l&#39;abbattimento da costrutti shRNA, o trattamenti farmacologici. Queste tecniche permettono ai ricercatori di iniziare a sezionare il ruolo di proteine ​​associate alla malattia e per prevedere come le mutazioni di queste proteine ​​possono funzionare in vivo.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

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