Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

המימון ניתן על ידי להילחם עבור Sight ומחקר כדי למנוע עיוורון.

1. קטע Anterior לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה Scleral האחורי של לימבוס נתפסת עם המלקחיים 0.22 ו הגלובוס (כדור העין) הוא התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להב microsurgical משמש לביצוע חתך ליניארי הקרנית מ לימבוס כדי לימבוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.12 קוליברי המלקחיים מכן נעשה שימוש כדי לתפוס את הקרנית על החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל תא קדמי נספג אז עם חנית Weck-cel כירורגי. </li></ol> 2. עדשה הוצאת הקרביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.12 קוליברי המלקחיים לתפוס את הקרנית משמש כדי לייצב את כדור הארץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל קנס מחט מעוקל (או מלקחיים ההלבשה מעוקל) מוכנס מאחורי העדשה כלפי הצד האחורי של כדור הארץ. בעל מחט סגור חלקית, ומשך קדימה. הלחץ מיושם באמצעות מלקחיים על פני השטח החיצוניים של בלובן העין, אשר דוחף קדימה את העדשה דרך חתך בקרנית תוך השארת קיר שלם העין. זגוגי נראה כמו ג&#39;ל שקוף, והוא חסיד חלקית העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה עדשה זגוגי ממוקם אז לתוך צינור צנטריפוגה מסונן המכיל 20 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז (Roche) מומס PBS. </li></ol> 3. רשתית הוצאת הקרביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לייצב את העולם עם 0.12 מלקחיים קוליברי לתפוס את חתך בקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל קנס מחט מעוקל (או מלקחיים ההלבשה מעוקל) ממוקם כ האחורי בהרבה הגלובוס ככל האפשר, ליד עצב הראייה. בעל מחט סגור חלקית, ומשך קדימה. הלחץ מיושם באמצעות מלקחיים על פני השטח החיצוניים של בלובן העין, אשר דוחפת את הרשתית קדימה דרך חתך בקרנית. זגוגי נראה כמו ג&#39;ל שקוף חסיד אל הרשתית. הרשתית היא דמיינו כמו רקמה צהוב vascularized,. כל רצועות של רקמות פיגמנט ניתן התקלף עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הרשתית-זגוגי ממוקם אז לתוך הצינור צנטריפוגות מסונן המכיל את רקמת עדשה זגוגי. </li></ol> 4. מסוננים צנטריפוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגות מסוננים ממוקם צנטריפוגה benchtop. ספין על 14,000 x G במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב eluant מן החדר התחתון, המהווה את הזגוגית. הרשתית נשאר בחדר העליון. דגימות אלה יכול להיות מנוצל ללימודים חלבון. </li></ol> 5. נציג תוצאות דגימות הזגוגיות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 2). דוגמאות ששימשו גם assay הפעילות האנזימטית (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. דיאגרמה עכבר עין. חתך סכימטי של העין האנושית ועכבר מציג את נפח קטן יחסית הזגוגית בעין את העכבר בשל העדשה שלו גדול יותר. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. חד ממדית SDS-PAGE של הזגוגית העכבר הרשתית. חלבון פרופילים של הזגוגית העכבר, 13.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(מסלול 1), רשתית, 11.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(מסלול 2). ג&#39;ל אלקטרופורזה בוצע ב kV 150 במשך 45 דקות, מוכתם פלמינגו פלורסנט כתם ג&#39;ל דמיינו באמצעות מערכת דימות VersaDoc (BioRad, הרקולס, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Superoxide dismutase (SOD) האנזים פעילות העכבר זגוגי האדם. מדידה של פעילות SOD הכולל (פעילות SOD colorimetric aasay הערכה, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) בוצע על הזגוגית לבין הרשתית שנאספו על ידי הוצאת הקרביים מעכברים DBA ו לבקנים. זה היה לעומת פעילות הליבה SOD זגוגי האדם הרשתית האנושית שנאספו שלאחר המוות בעיניים התורם האנושי כדי לקבוע פעילות יחסי. חי דגימות ליבה זגוגי היו aspirated באופן ידני באמצעות מחט 23-מד, 11 ו הרשתית נאסף על ידי פריחה העין חיתוך הרקמה מן הרשתית מורכבת / דמית העין. למרות assay אינו מבחין בין isoforms SOD, הפעילות SOD זגוגי עשוי לשקף SOD3, שכן הוא איזופורם רק תאיים 12 הפעילות SOD הרשתית עשוי לשקף את כל isoforms SOD שלושה:. SOD1 תאיים, המיטוכונדריה SOD2 ו תאיים SOD3. האנזימטית 12 עבור מבחני רגישות גבוהה, כולל assay זה SOD, את האפשרות של זיהום צולב של חלבונים אפשרי ודורש מחקר נוסף. ברים שגיאה מייצגים SEM.

<ol>
	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).</li><li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene.">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li><li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+Stickler's+syndrome:+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+(pro)collagen+gene+(Col2a1.">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li><li>Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII/endostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome.">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li><li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene.">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis.">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes.">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם האגודה למחקר חזון בהצהרה עיניים לשימוש של בעלי חיים עיניים ומחקר החזון.

העכברים הטרנסגניים מהווים מודל חשוב לחקר מחלת הרשתית vitreoretinal. 6-10 הגוף הזגוגי העכבר, לעומת זאת, מהווה חלק קטן יותר באופן משמעותי של העין בהשוואה זגוגי האדם בשל העדשה גדול בעין העכבר. 5 זה עושה קשה לבודד ולטהר את הזגוגית העכבר. הבנת השינויים חלבון קשורה הזגוגית במהלך מחלות כגון רטינופתיה סוכרתית שגשוג, הקשורות לגיל ניוון מקולרי, uveitis, ועל ניתוק הרשתית ייתן תובנה המנגנונים שבאמצעותם הם התקדמות. זה פרוטוקול הניסוי דמיינו מספק אמצעי להשיג לטהר את הגוף הזגוגי העכבר, תוך מיקסום התשואה חלבון עבור ניתוחים האנזימטית proteomic.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 15 °, BD בונה Microsurgical Blade </td><td> בקטון דיקינסון, </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 עדין Castroviejo תפירת מלקחיים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 קוליברי מלקחיים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon צנטריפוגלי סינון Ultracel YM-100 או YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> פעילות SOD ערכת Colorimetric Assay </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-cel כירורגית חניתות </td><td> מדטרוניק </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> מעכב פרוטאז קוקטייל </td><td> רוש </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל פלמינגו פלורסנט כתם </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

בעוד הרשתית עכבר התפתחה כמודל גנטי חשוב למחלות רשתית תורשתיות, הזגוגית העכבר נשאר כדי להיחקר. זגוגי הוא תאי מטריקס מימית מאוד המכסה את הרשתית שבו התוך עיני, כמו גם חלבונים extraocular לצבור במהלך המחלה. אינטראקציות בין 1-3 חריגות זגוגי ו הרשתית ביסוד מספר מחלות כגון ניתוק הרשתית, רטינופתיה סוכרתית שגשוג, uveitis, ו vitreoretinopathy שגשוג 1. , 4 נפח יחסית זגוגי העכבר הוא קטן יותר באופן משמעותי זגוגי האנושי (איור 1), כיוון את העדשה העכבר תופס כמעט 75% של העין שלה. 5 זה עשה מחקרים ביוכימיים של הזגוגית עכבר מאתגר. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקה לנתח ולבודד את העכבר מן הזגוגית הרשתית, אשר יאפשר שימוש במודלים עכבר מהונדס יותר להגדיר בבירור את תפקידו של מטריצה ​​זו תאיים בהתפתחות של מחלות vitreoretinal.

Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

הטכניקה לנתיחה מדגים הוצאת הקרביים של הזגוגית, הרשתית, ואת העדשה מהעין העכבר, הפרדה על ידי צנטריפוגה, ואפיון עם מבחני חלבון.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Horizontal Slice Preparation of the Retina

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Electrophoretic Separation of Proteins

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblot ניתוח

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

ניתוח נתונים תלולים מסלול לחקר חלל פעילות הולכי רגל בזמן

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...