Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
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Il finanziamento è stato fornito da Lotta per la vista e la ricerca per prevenire la cecità.

1. Dissezione del segmento anteriore. <ol><li> Tessuto sclerale posteriormente al limbus è afferrato con una pinza 0,22 e il globo (bulbo oculare) è stabilizzata. </li><li> Una lama microchirurgico è usato per fare un&#39;incisione lineare nella cornea da limbus a limbus. </li><li> Un Colibri 0,12 pinza viene quindi utilizzata per afferrare la cornea alla incisione. </li><li> Il fluido della camera anteriore viene poi assorbito con un Weck-Cel lancia chirurgico. </li></ol> 2. Lens eviscerazione. <ol><li> Un Colibri 0,12 pinza afferrare la cornea viene utilizzato per stabilizzare il mondo. </li><li> Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) viene inserito dietro l&#39;obiettivo verso la parte posteriore del globo. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la lente attraverso l&#39;incisione della cornea lasciando intatta la parete dell&#39;occhio. Il vitreo si presenta come un gel trasparente ed è parzialmente aderente alla lente. </li><li> L&#39;obiettivo vitreo-tessuto viene poi inserito in un tubo di centrifugazione filtrato contenente 20 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi (Roche) disciolto in PBS. </li></ol> 3. Retina eviscerazione. <ol><li> Continuare a stabilizzare il mondo con 0,12 pinze Colibri cogliere l&#39;incisione della cornea. </li><li> Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) è posta per quanto possibile posteriore al mondo il più possibile, vicino al nervo ottico. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la retina attraverso l&#39;incisione della cornea. Il vitreo si presenta come un gel trasparente aderente alla retina. La retina è visualizzato come un giallo, il tessuto vascolarizzato. Le strisce di tessuto pigmentato può essere staccato con una pinza. </li><li> La retina, vitreo tessuto viene poi inserito nel tubo da centrifuga filtrato contenente l&#39;obiettivo vitreo-tessuto. </li></ol> 4. Filtrata centrifugazione. <ol><li> Il tubo di centrifuga filtrato viene posto in una centrifuga da banco. Girano a 14.000 g per 12 minuti. </li><li> Aspirare il eluente dalla camera inferiore, che è il vitreo. La retina rimane nella sala al piano superiore. Questi campioni possono essere utilizzati per gli studi di proteine. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Vitreo campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 2). I campioni sono stati utilizzati anche per un saggio di attività enzimatica (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagramma a occhio Mouse. Trasversale schematica dell&#39;occhio umano e del mouse mostra il volume relativo vitreo più piccoli nell&#39;occhio del mouse grazie al suo obiettivo più grande. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Monodimensionale SDS-PAGE di vitreo del mouse e della retina. Profili proteici di vitreo topo, 13,6 mg / ml (corsia 1), e della retina, 11,35 mg / ml (corsia 2). Elettroforesi su gel è stata effettuata a 150 kV per 45 minuti, macchiata di macchia gel Flamingo fluorescenti ed è visualizzato mediante un sistema di VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Superossido dismutasi (SOD) attività enzimatica nel topo e nel vitreo umano. Misurazione dell&#39;attività SOD totale (SOD attività colorimetrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) è stata eseguita su vitreo e retina raccolte eviscerazione dai topi DBA e albino. Questo è stato confrontato con attività SOD nel cuore umano vitreo e retina umana raccolti da post-mortem occhi donatore umano per determinare l&#39;attività relativa. Non diluito carotaggi vitreo sono stati aspirati manualmente utilizzando una 23-gauge, 11 e retina è stato raccolto dalla fioritura l&#39;occhio e il taglio del tessuto dal RPE / coroide complesso. Anche se il test non fa distinzione tra isoforme SOD, l&#39;attività SOD vitreo è probabile che SOD3 riflettere, dal momento che è l&#39;unica isoforma extracellulare 12 L&#39;attività SOD retina riflette probabilmente tutte le isoforme SOD tre:. Intracellulare SOD1, mitocondriale SOD2, ed extracellulare SOD3. 12 Per saggi enzimatici altamente sensibili, tra cui questo saggio SOD, la possibilità di contaminazione incrociata di proteine ​​è possibile e richiede ulteriori studi. Barre di errore rappresentano SEM.

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Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l&#39;Associazione per la Ricerca e della visione nella dichiarazione Oftalmologia per l&#39;uso degli animali nel oftalmica e di ricerca Vision.

Topi transgenici sono un importante modello per lo studio delle malattie della retina e vitreo-retinica. 6-10 Il corpo vitreo del mouse, invece, comprende una proporzione significativamente più piccola dell&#39;occhio rispetto al corpo vitreo umano a causa della grande lente nell&#39;occhio del mouse. 5 Questo rende difficile isolare e purificare il corpo vitreo del mouse. Comprendere i cambiamenti delle proteine ​​associate al vitreo in corso di malattie come la retinopatia diabetica proliferativa, età degenerazione maculare, uveite, e distacco della retina darà comprensione dei meccanismi con cui si progresso. Questo protocollo visualizzati sperimentale fornisce un mezzo per ottenere e purificare il corpo vitreo del mouse, massimizzando la resa di proteine ​​enzimatiche e di analisi proteomica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver microchirurgica Lama </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo sutura Pinza </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrollore centrifuga Filtro Ultracel YM-100 o YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD Attività colorimetrico Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgico lance </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel fluorescenti macchia </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

Mentre la retina del mouse è emersa come un importante modello genetico per le malattie ereditarie della retina, il vitreo mouse rimane da esplorare. Il vitreo è una matrice extracellulare altamente acquosa sovrastante la retina dove intraoculare così come le proteine ​​extraoculari si accumulano durante la malattia. 1-3 interazioni anomale tra vitreo e la retina alla base di numerose malattie come il distacco di retina, retinopatia diabetica proliferativa, uveite, e proliferazione vitreoretinica 1. , 4 Il volume relativo vitreo del mouse è significativamente più piccolo del vitreo umano (Figura 1), dal momento che l&#39;obiettivo del mouse occupa quasi il 75% del suo occhio. 5 Questo ha fatto studi biochimici del vitreo del mouse impegnativo. In questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per sezionare ed isolare il vitreo del mouse dalla retina, che permetterà l&#39;uso di modelli di topi transgenici per definire più chiaramente il ruolo di questa matrice extracellulare nello sviluppo di patologie vitreo-retinica.

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Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

La tecnica di dissezione illustra l&#39;eviscerazione del vitreo, retina, e la lente dall&#39;occhio del mouse, la separazione mediante centrifugazione, e la caratterizzazione con i dosaggi della proteina.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

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