Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight and Research para prevenir a cegueira.

1. Dissecção do segmento anterior. <ol><li> Tecido escleral posterior ao limbo é apreendido com uma pinça 0,22 e do globo (globo ocular) é estabilizada. </li><li> Uma lâmina de microcirurgia é usado para fazer uma incisão linear na córnea a partir de limbo a limbo. </li><li> A Colibri 0,12 fórceps é então utilizado para captar a córnea na incisão. </li><li> O fluido da câmara anterior é então absorvida com uma lança Weck-Cel cirúrgico. </li></ol> 2. Evisceração lente. <ol><li> A Colibri 0,12 fórceps segurando a córnea é usada para estabilizar o mundo. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é inserido atrás da lente em direção ao aspecto posterior do globo. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, o que empurra a lente para a frente através da incisão da córnea, deixando a parede do olho intacto. O vítreo aparece como um gel transparente e é parcialmente aderente à lente. </li><li> O tecido vítreo-lente é então colocada em um tubo de centrifugação filtrado contendo 20 microlitros de cocktail inibidor da protease (Roche) dissolvido em PBS. </li></ol> 3. Evisceração retina. <ol><li> Continue para estabilizar o mundo com 0,12 forceps Colibri agarrar a incisão na córnea. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é colocado como muito posterior ao globo possível, perto do nervo óptico. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, que empurra a retina para a frente através da incisão da córnea. O vítreo aparece como um gel transparente aderente à retina. A retina é visualizado como um amarelo tecido vascularizado,. Quaisquer tiras de tecido pigmentada pode ser desfeito, com uma pinça. </li><li> O tecido da retina vítreo é então colocado no tubo de centrifugação filtrada contendo o tecido lente vítrea. </li></ol> 4. Filtrada centrifugação. <ol><li> O tubo de centrifugação filtrado é colocado em uma centrífuga de bancada. Giram a 14.000 x G por 12 minutos. </li><li> Aspirar o eluente da câmara baixa, que é o vítreo. A retina permanece na câmara superior. Essas amostras podem ser utilizados para estudos de proteínas. </li></ol> 5. Resultados representante As amostras vítreas foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 2). As amostras também foram utilizados para um ensaio de atividade enzimática (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Rato diagrama de olho. Transversal esquemático do olho humano e do rato mostra o volume vítreo relativa menor no olho do rato, devido à sua maior lente. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE do vítreo mouse e retina. Perfis de proteínas do vítreo mouse, 13,6 mg / mL (pista 1) e retina, 11,35 mg / mL (faixa 2). Eletroforese em gel foi realizada em 150 kV por 45 minutos, corados com Flamingo gel fluorescente mancha e visualizado através de um sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Superóxido dismutase atividade enzimática (SOD) no rato e vítreo humano. Medição da atividade SOD total (SOD atividade colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) foi realizada em vítreo e retina coletados por evisceração de camundongos DBA e albino. Este resultado foi comparado à atividade SOD no núcleo vítreo humano e retina humana coletados de post-mortem olhos de doadores humanos para determinar a atividade relativa. Diluído amostras de núcleo vítreo foram aspirados manualmente utilizando uma agulha 23 gauge, 11 e retina foram coletados por floração o olho e cortar o tecido de distância do complexo EPR ​​/ coróide. Embora o ensaio não faz distinção entre as isoformas da SOD, a atividade SOD vítreo é provável que refletem SOD3, uma vez que é apenas a isoforma extracelular 12 A atividade de SOD retina é susceptível de reflectir todas as isoformas da SOD três:. SOD1 intracelular, SOD2 mitocondrial, e extracelulares SOD3. 12 Porque altamente sensível ensaios enzimáticos, incluindo este ensaio SOD, a possibilidade de contaminação cruzada de proteínas é possível e requer um estudo mais aprofundado. Barras de erro representam SEM.

<ol>
	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).</li><li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene.">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li><li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+Stickler's+syndrome:+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+(pro)collagen+gene+(Col2a1.">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li><li>Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII/endostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome.">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li><li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene.">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis.">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes.">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação para a Investigação e Visão em Oftalmologia declaração para o uso de animais em oftálmica e Vision Research.

Camundongos transgênicos são um importante modelo para a investigação de doenças da retina e vítreo-retinianas. 6-10 O corpo vítreo mouse, no entanto, compreende uma proporção significativamente menor do olho em relação ao vítreo humano devido ao grande lente no olho do rato. 5 Isso faz com que difícil isolar e purificar o vítreo mouse. Compreensão das mudanças proteína associada com o vítreo durante doenças como a retinopatia diabética proliferativa, relacionadas com a idade degeneração macular, uveíte e descolamento de retina vai dar dicas sobre os mecanismos pelos quais o progresso. Este protocolo experimental visualizadas fornece um meio para obter e purificar o corpo vítreo do mouse e maximizar a produção de proteína para as análises enzimáticas e proteômica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Microsurgical Lâmina </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Pinça Castroviejo Sutura </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrolador Centrífuga Filtro Ultracel YM-100 ou YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> Atividade SOD Kit de Ensaio Colorimétrico </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel cirúrgica lanças </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Protease cocktail inibidor </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel fluorescente mancha </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

Enquanto a retina do rato tem emergido como um importante modelo genético para a doença hereditária da retina, o vítreo do mouse continua a ser explorado. O vítreo é uma matriz extracelular altamente aquosa que recobre a retina, onde intra-ocular, bem como proteínas extraocular acumulam durante a doença. 1-3 interações anormais entre vítreo e retina subjazem diversas doenças, como descolamento de retina, retinopatia diabética proliferativa, uveíte e Vitreorretinopatia proliferativa 1. , 4 O volume vítreo relativa do mouse é significativamente menor do que o vítreo humano (Figura 1), uma vez que a lente do mouse ocupa quase 75% do seu olho. 5 Isso fez com que estudos bioquímicos do vítreo do mouse desafiador. Neste artigo de vídeo, apresentamos uma técnica para dissecar e isolar o vítreo da retina do rato, que vai permitir o uso de modelos de ratos transgênicos para definir mais claramente o papel dessa matriz extracelular no desenvolvimento de doenças vítreo-retinianas.

Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Preparação Slice horizontal da Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biologia

Electrophoretic Separation of Proteins

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Análise immunoblot

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Coloração Proteínas em Gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

Trajetória Análise de Dados para Estudo de Atividade pedonal espaço-tempo

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...