Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Финансирование было предоставлено Борьба за зрение и исследований в области профилактики слепоты.

1. Передняя рассечение сегмента. <ol><li> Склеры ткани кзади от лимба схватывается с 0,22 forcep и миру (глазного яблока) стабилизируется. </li><li> Микрохирургические лезвия используется, чтобы сделать линейный разрез в роговице от лимба до лимба. </li><li> 0,12 Colibri forcep затем используется для понимания роговицы на разрез. </li><li> Жидкости передней камеры затем поглощается с Weck-Cel хирургических копьем. </li></ol> 2. Объективы потрошения. <ol><li> 0,12 Colibri forcep схватив роговицы используется для стабилизации земного шара. </li><li> Тонкая изогнутая держатель иглы (или изогнутые корнцанг) вставляется позади объектива на задней поверхности земного шара. Иглодержателя частично закрыты, и потянул вперед. Давление применяется с использованием щипцов на внешней поверхности склеры, которая толкает вперед через объектив роговицы разрез, оставляя глаза стены нетронутыми. Стекловидного выглядит как полупрозрачный гель и частично приверженцем линзы. </li><li> Линз стекловидного ткани затем помещаются в фильтруются центрифугирования пробирку, содержащую 20 мкл ингибитора протеазы коктейль (Roche), растворенного в PBS. </li></ol> 3. Сетчатка потрошения. <ol><li> Продолжить для стабилизации земного шара с 0,12 щипцы Colibri схватив роговицы разрез. </li><li> Тонкая изогнутая держатель иглы (или изогнутые корнцанг) помещается насколько кзади от мира, как возможно, недалеко от зрительного нерва. Иглодержателя частично закрыты, и потянул вперед. Давление применяется с использованием щипцов на внешней поверхности склеры, которая толкает вперед через сетчатку роговицы разрез. Стекловидного выглядит как полупрозрачный гель приверженцем сетчатки. Сетчатка визуализируется в виде желтой, ткани васкуляризированной. Любой полосы пигментированные ткани могут быть очищены от щипцами. </li><li> Сетчатки стекловидного ткани помещают в центрифугу фильтром трубку с линзой-стекловидного ткани. </li></ol> 4. Фильтрованный центрифугирования. <ol><li> Фильтруется центрифужную пробирку помещают в центрифугу настольный. Спиновые при 14000 х G в течение 12 минут. </li><li> Аспирируйте элюента от нижней палаты, который является стекловидного тела. Сетчатки остается в верхней палате. Эти образцы могут быть использованы для исследования белков. </li></ol> 5. Представитель Результаты Стекловидное пробы анализировались SDS-PAGE (рис. 2). Образцы были также использованы для анализа ферментативной активности (рис. 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Мышь глаз диаграмме. Поперечные схема человека и мыши глаз показывает относительную меньше объема стекловидного мыши глаз из-за его больших линз. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Одномерные SDS-PAGE стекловидного тела и сетчатки мышей. Белки профили мыши стекловидное, 13,6 мг / мл (дорожка 1) и сетчатки, 11,35 мг / мл (дорожка 2). Гель-электрофорез проводили при 150 кВ в течение 45 минут, окрашивали Фламинго флуоресцентный гель пятна и визуализируется с помощью системы VersaDoc Imaging (BioRad, Геркулес, Калифорния). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. Супероксиддисмутазы (СОД), активность фермента у мышей и человека стекловидного тела. Измерение общей активности СОД (СОД активности колориметрических aasay комплект, # AB65354, Abcam, Inc, Кембридж, Массачусетс) был выполнен на стекловидное тело и сетчатку собранные потрошения от администраторов баз данных и белых мышей. Это было по сравнению с активность СОД у человека стекловидное ядро ​​и сетчатке глаза человека собраны из посмертных доноров человеческих глаз, чтобы определить относительную активность. Неразведенный стекловидного кернов были вручную атмосферный использованием 23-иглы, 11 и сетчатки была собрана цветущие глаза и резки ткани от НПП / сосудистого комплекса. Хотя анализ не делает различия между СОД изоформ, стекловидное активности SOD, вероятно, отражает SOD3, так как это только внеклеточной изоформы 12 активности сетчатки SOD, вероятно, отражает все три изоформы СОД. Внутриклеточных SOD1, митохондриальная SOD2, и внеклеточной SOD3 12. Для высокочувствительного ферментативные анализы, в том числе это СОД анализ, возможности перекрестного загрязнения белков можно и требует дальнейшего изучения. Планки погрешностей представляют SEM.

<ol>
	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).</li><li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene.">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li><li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+Stickler's+syndrome:+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+(pro)collagen+gene+(Col2a1.">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li><li>Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII/endostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome.">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li><li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene.">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis.">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes.">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li></ol>

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Ассоциацией по исследованиям и видение в офтальмологии и убытках за использование животных в офтальмологической и Vision Research.

Трансгенные мыши являются важной моделью для исследования сетчатки и витреоретинальной болезни. 6-10 тела мыши стекловидного тела, однако, включает в себя значительно меньшую долю глаза по сравнению с человеческой стекловидного из-за большого линзы в глаз мыши 5. Это делает его трудно выделить и очистить мышь стекловидного тела. Понимание белка изменения, связанные с стекловидного во время болезни, такие как пролиферативная диабетическая ретинопатия, возрастной макулярной дегенерации, увеит, отслойка сетчатки и даст понимание механизмов, посредством которых они прогрессируют. Это визуализируется экспериментальный протокол предоставляет возможность получить и очистить тело мыши стекловидное тело, при максимальном выход белка для ферментативных и протеомных анализов.

<table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> 15 °, Б. Д. Бивер Микрохирургическая Клинок </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, рН 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Тонкая Кастровьехо Наложение швов Пинцет </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri щипцы </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Микроконтроллер центробежный фильтр Ultracel YM-100 или YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> СОД активность колориметрический Kit Пробирной </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel хирургических копья </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Ингибитор протеазы коктейль </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Фламинго флуоресцентный гель пятно </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

В то время как мыши сетчатки стала важной генетической модели унаследовали заболевания сетчатки, стекловидного мыши еще предстоит изучить. Стекловидного является высоко водный внеклеточного матрикса вышележащих сетчатки, где внутриглазное а также экстраокулярных белки накапливаются во время болезни. 1-3 Аномальные взаимодействия между стекловидного тела и сетчатки лежат в основе ряда заболеваний, таких как отслойка сетчатки, пролиферативная диабетическая ретинопатия, увеит, и пролиферативной витреоретинопатия 1. , 4 относительного объема стекловидного мыши существенно меньше, чем человеческие стекловидное (рис. 1), поскольку мышь объектив занимает почти 75% ее глаза. 5 Это сделало биохимических исследований мыши стекловидного сложной задачей. В этом видео статьи, мы представляем технику препарировать и изолировать мыши стекловидного от сетчатки, которая позволит использовать трансгенных моделей мыши, чтобы более четко определить роль этого внеклеточного матрикса в развитии витреоретинальной заболеваний.

Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Рассечение техника иллюстрирует потрошения стекловидного тела, сетчатки и объектив от мыши глаз, разделение центрифугированием, и характеристика с белком анализов.

Evisceration стекловидного тела и сетчатки мышь для протеомных Анализы

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Горизонтальное Подготовка Кусочек сетчатки

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Электрофоретического разделения белков

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Анализ Вестернблот

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Окрашивание белков в гелях

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Индукционная токсина и белка Извлечение из Fusarium Sрр. Культуры для протеомных исследований

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

Траектория Анализ данных для пешеходного пространства-времени активность исследование

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...