Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Finansieringen kom från Fight for Sight och forskning för att förebygga blindhet.

1. Främre segmentet dissekering. <ol><li> Skleral vävnad posteriort om limbus är fattade med 0,22 forcep och världen (ögat bollen) har stabiliserats. </li><li> En mikrokirurgisk blad används för att göra en linjär snitt i hornhinnan från limbus till limbus. </li><li> En 0,12 Colibri forcep används sedan för att ta tag i hornhinnan på snittet. </li><li> Den främre kammaren vätskan tas sedan upp med en Weck-Cel kirurgiska spjut. </li></ol> 2. Lens urtagning. <ol><li> En 0,12 Colibri forcep greppa hornhinnan används för att stabilisera världen. </li><li> En fin böjd nål (eller böjda dressing pincett) förs in bakom linsen mot den bakre delen av världen. Nålen hållaren är delvis stängd, och dras framåt. Trycket appliceras med hjälp av pincetten på utsidan av sklera, som driver objektivet framåt i hornhinnan snittet medan ögat vägg intakt. Glaskroppen visas som en genomskinlig gel och är delvis anhängare till linsen. </li><li> Linsen-glaskroppen vävnad placeras sedan i en filtrerad centrifugering rör som innehåller 20 mikroliter av proteashämmare cocktail (Roche) upplöst i PBS. </li></ol> 3. Retina urtagning. <ol><li> Fortsätt att stabilisera världen med 0,12 Colibri pincett greppa hornhinnan snittet. </li><li> En fin böjd nål (eller böjda dressing pincett) är placerad så långt posteriort om världen som möjligt, nära synnerven. Nålen hållaren är delvis stängd, och dras framåt. Trycket appliceras med hjälp av pincetten på utsidan av sklera, som tänjer på näthinnan framåt i hornhinnan snittet. Glaskroppen visas som en genomskinlig gel anhängare till näthinnan. Näthinnan är visualiseras som en gul, vaskulariserad vävnad. Varje band av pigmenterad vävnad kan skäras bort med pincett. </li><li> Näthinnan, glaskroppen vävnad placeras sedan i den filtrerade centrifugrör som innehåller linsen, glaskroppen vävnad. </li></ol> 4. Filtrerad centrifugering. <ol><li> Den filtrerade centrifugrör är placerad i en bänk centrifug. Snurra på 14.000 x G i 12 minuter. </li><li> Aspirera eluant från den nedre kammaren, som är glaskroppen. Näthinnan finns kvar i den övre kammaren. Dessa prover kan användas för protein studier. </li></ol> 5. Representativa resultat Glaskropp prover analyserades av SDS-PAGE (figur 2). Prover har också använts för en enzymatisk aktivitet analys (Figur 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Mouse öga diagram. Tvärsnittsarea schematisk av det mänskliga och mus ögat visar den relativa mindre glaskroppen volym i musen ögat på grund av dess större lins. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Endimensionell SDS-PAGE av mus glaskroppen och näthinnan. Protein profiler musen glaskroppen, 13,6 mg / ml (bana 1) och näthinnan, 11,35 mg / ml (bana 2). Gelelektrofores utfördes på 150 kV i 45 minuter, färgade med Flamingo fluorescerande gel fläcken och visualiseras med hjälp av en VersaDoc Imaging-system (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Superoxiddismutas (SOD) enzymaktiviteten hos mus och människa glaskroppen. Mätning av den totala SOD aktivitet (SOD aktivitet kolorimetriska aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) utfördes på glaskroppen och näthinnan som samlas in av urtagning från DBA och albino möss. Detta jämfördes med SOD aktiviteten i human glaskroppen kärna och mänskliga näthinnan som samlas in från obduktioner mänskliga givare ögon för att bestämma relativ aktivitet. Outspädd glaskropp borrkärnor var manuellt sugs med hjälp av en 23-gauge kanyl, 11 och näthinnan samlades in av blommande ögat och skära av vävnad från RPE / koroidea komplex. Även om analysen inte skiljer på SOD isoformer är glaskroppen SOD verksamhet som skulle kunna spegla SOD3, eftersom det är den enda extracellulära isoformen 12 Näthinnan SOD aktiviteten sannolikt spegla alla tre SOD isoformer:. Intracellulär SOD1, mitokondrie SOD2 och extracellulära SOD3. 12 För mycket känslig enzymatiska analyser, inklusive denna SOD analys, är möjligheten att korskontaminering av proteiner och kräver ytterligare studier. Felstaplar representerar SEM.

<ol>
	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).</li><li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene.">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li><li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+Stickler's+syndrome:+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+(pro)collagen+gene+(Col2a1.">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li><li>Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII/endostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome.">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li><li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene.">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis.">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes.">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li></ol>

Försök på djur har utförts i enlighet med Föreningen för forskning och Vision i oftalmologi uttalande för användning av djur i ögondroppar och Vision Research.

Transgena möss är en viktig modell för att undersöka näthinnan och vitreoretinala sjukdom. 6-10 Musen glaskroppen kroppen, men utgör en betydligt mindre andel av ögat i jämförelse med den mänskliga glaskroppen grund av den stora linsen i musen ögat. 5 Det gör det svårt att isolera och rena musen glaskroppen. Förstå protein förändringar i samband med glaskroppen vid sjukdomar som proliferativ diabetesretinopati, åldersrelaterad makuladegeneration, uveit och näthinneavlossning kommer att ge insikt i de mekanismer genom vilka de framsteg. Detta visualiseras försöksprotokoll ger en möjlighet att få och rena kroppen musen glaskroppen, samtidigt maximera protein avkastningen för enzymatiska och proteomik analyser.

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver mikrokirurgisk Blade </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374.881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Castroviejo Suturering Tång </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri pincett </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon Centrifugal Filter Ultracel YM-100 eller YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42.412, 42.415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD aktivitet Kolorimetriska analys Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel kirurgiska spjut </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Proteashämmare cocktail </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo fluorescerande gel fläcken </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04.910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

Medan musen näthinnan har vuxit fram som en viktig genetisk modell för ärftlig näthinnesjukdom förblir musen glaskroppen på att utforskas. Glaskroppen är en mycket vatten extracellulärmatrix överliggande näthinnan där intraokulära samt extraocular proteiner ackumuleras under sjukdomen. 1-3 Onormala interaktioner mellan glaskroppen och näthinnan ligger till grund för flera sjukdomar såsom näthinneavlossning, proliferativ diabetisk retinopati, uveit och proliferativa vitreoretinopathy. 1 , 4 Den relativa musen glaskroppen volym är betydligt mindre än den mänskliga glaskroppen (figur 1), eftersom musen linsen upptar nästan 75% av sitt öga. 5 Detta har gjort biokemiska studier av mus glaskroppen utmanande. I denna video artikeln presenterar vi en teknik för att dissekera och isolera musen glaskroppen från näthinnan, vilket kommer att tillåta användning av transgena musmodeller för att tydligare definiera vilken roll denna extracellulära matrix i utvecklingen av vitreoretinala sjukdomar.

Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Den dissektion Tekniken illustrerar urtagning av glaskroppen, näthinnan och linsen från musen ögat, separation genom centrifugering, och karakterisering av protein-analyser.

Urtagning av Mouse glaskroppen och näthinnan för proteomik analyser

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Horisontell Skiva Beredning av näthinnan

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektrofores separation av proteiner

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblot Analys

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Infärgning Proteiner i Geler

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digital Mikrofluidik för automatiserad proteomik Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxinvapen Induktion och Protein Extraction från Fusarium SPP. Kulturer för proteomik studier

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Isolering av Översätta Ribosomer Med peptidyl-tRNAs för funktionella och strukturella analyser

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

Bandata Analyser för fotgängare Space-time studieboken

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...