Name: evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Finansman Görüş ve Körlük Önlemek için Araştırma için mücadele sağlanmıştır.

1. Ön segment diseksiyonu. <ol><li> Limbus posterior skleral doku 0.22 forsepsle ve dünya (göz topu) stabilize ile kavradı. </li><li> Mikrocerrahi bıçak limbustan limbus kornea doğrusal bir kesi yapmak için kullanılır. </li><li> A 0.12 Colibri forsepsle sonra kornea kesi kavramak için kullanılır. </li><li> Ön kamara sıvısı sonra Weck-Cel cerrahi mızrak ile emilir. </li></ol> 2. Lens eviserasyon. <ol><li> Kornea açgözlü bir 0.12 Colibri forsepsle dünya stabilize etmek için kullanılır. </li><li> Dünyanın arka yönüyle doğru objektif arkasında ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps) eklenir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç göz duvarında olduğu gibi bırakarak korneal kesiden lens ileri iter sklera, dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus saydam bir jel gibi görünür ve objektif kısmen yapışık. </li><li> Lens vitreus dokusu daha sonra PBS içinde çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) 20 mikrolitre içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpü içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Retina eviserasyon. <ol><li> Korneal kesi açgözlü 0.12 Colibri forseps ile dünya stabilize etmek için devam edin. </li><li> Ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps), optik sinir yakınında, mümkün olduğu kadar dünya arka yerleştirilir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç, sklera, retina korneal kesiden ileri iter dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus retina yapışık yarı saydam bir jel gibi görünür. Retinada sarı, damarlı bir doku olarak görünür. Herhangi bir pigmentli doku şeritler forseps ile soyulmuş olabilir. </li><li> Retina-vitreus dokusu daha sonra lens vitreus dokusu içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. </li></ol> 4. Santrifüj Filtreli. <ol><li> Benchtop santrifüj süzülmüş santrifüj tüp yerleştirilir. 12 dakika 14.000 x G Spin. </li><li> Vitreus alt odası, eluant aspire. Retinanın üst odasında kalır. Bu örnekler, protein çalışmaları için kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Vitreus örnekleri, SDS-PAGE (Şekil 2) ile analiz edildi. Örnekleri de bir enzimatik aktivite assay (Şekil 3) için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Fare göz diyagramı. Insan ve fare göz kesit şematik büyük lens nedeniyle fare göz göreceli küçük vitreus hacmi gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Bir boyutlu SDS-PAGE fare vitreus ve retina. Protein fare vitreus profilleri, 13.6 mg / ml (şerit 1), ve retina, 11.35 mg / ml (2 şeritli). Jel elektroforezi Flamingo floresan jel boyası ile boyanmış, 45 dakika için 150 kV ve VersaDoc Görüntüleme sistemi (BioRad, Hercules, CA) kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Fare ve insan vitreus Süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitesi. Toplam SOD aktivitesi ölçümü (SOD aktivitesi kolorimetrik aasay kiti, # AB65354 Abcam, Inc, Cambridge, MA), DBA ve albino fareler eviserasyon tarafından toplanan vitreus ve retina üzerinde yapıldı. Bu insan vitreus çekirdek ve göreceli etkinliğini belirlemek için post-mortem insan donör gözleri toplanan insan retina SOD aktivitesi ile karşılaştırıldı. Sulandırılmamış vitreus karot numuneleri elle, 23 gauge iğne, 11 ve retina göz çiçekli ve RPE / koroid kompleksi uzak doku kesim tarafından toplanan ile aspire edildi . Tahlil SOD izoformları arasında ayrım yapmaz rağmen sadece ekstraselüler izoformu olduğundan, vitreus SOD aktivitesi, SOD3 yansıtmak için büyük olasılıkla 12 retinanın SOD aktivitesi üç SOD izoformları yansıtması muhtemeldir. Intrasellüler SOD1, mitokondriyal SOD2 ve ekstrasellüler SOD3. (12), bu SOD tahlil da dahil olmak üzere son derece hassas enzimatik Testler için, proteinlerin çapraz bulaşma olasılığı mümkündür ve daha fazla çalışma gerektirir. Hata çubukları SEM temsil eder.

<ol>
	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).</li><li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene.">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li><li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+Stickler's+syndrome:+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+(pro)collagen+gene+(Col2a1.">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li><li>Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII/endostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome.">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li><li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene.">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis.">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes.">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li></ol>

Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanları Kullanım için Oftalmoloji açıklamada Araştırma ve Vizyon Derneği uyarınca hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Transgenik farelerde retinal ve vitreoretinal hastalığın araştırılması için önemli bir model. 6-10 fare vitreus, ancak, büyük fare göz lens nedeniyle insan vitreus ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az oranda göz oluşmaktadır. 5 Bu yapar zor fare vitreus izole etmek ve arındırmak için. Onlardır ki, ilerleme, proliferatif diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, üveit, retina dekolmanı ve gibi hastalıklar sırasında vitreus ile ilişkili protein değişiklikleri anlamak mekanizmalarına fikir verecektir. Bu görüntülenmiştir deney protokolünde, enzimatik ve proteomik analizleri için protein verimi en üst düzeye çıkarırken, fare vitreus elde etmek ve arındırmak için bir araç sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Mikrocerrahi Blade </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 İnce Castroviejo Sütür atmak Forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 Colibri forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon Santrifüj Filtre Ultracel YM-100 YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42.412, 42.415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD Aktivitesi Kolorimetrik Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel cerrahi spears </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo floresan jel leke </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses

Fare retina kalıtsal retina hastalıkları için önemli bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır, fare vitreus keşfedilmeyi beklemektedir. Vitreus hastalık sırasında göz içi yanı sıra ekstraoküler proteinler birikir retina üzerinde oldukça sulu bir ekstrasellüler matriks vitreus ve retina arasında 1-3 Anormal etkileşimleri, retina dekolmanı, proliferatif diyabetik retinopati, üveit ve proliferatif vitreoretinopati gibi çeşitli hastalıkların altında yatan 1 4 bağıl fare vitreus hacmi, fare objektif gözü yaklaşık% 75 işgal insan vitreus (Şekil 1) göre anlamlı derecede küçük. 5. Bu zorlu fare vitreus biyokimyasal çalışmalar yaptı. Bu video makalede, retina, transgenik fare modelleri bu ekstraselüler matriks vitreoretinal hastalıkların gelişiminde rolü daha net bir şekilde tanımlamak için izin fare vitreus incelemek ve izole etmek için bir teknik mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses at JoVE.com

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immüno Analizi

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Jeller içinde Proteinler Boyama

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

Yaya Uzay-zaman Aktivite Çalışmaları Yörünge Veri Analizleri

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...