Name: isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​MCB-0817827.

Isotherme titratie calorimetrie (ITC) is een gevestigde techniek die al de thermodynamische parameters (affiniteit, enthalpie en stoichiometrie) van een bindende interactie kan bepalen in een experiment. 1 ITC werkt door het titreren van een reactant in een tweede reactant onder isotherme omstandigheden. De gemeten signaal wordt de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd op interactie (binding) van de twee reactanten. Een reeks van injecties worden uitgevoerd en de warmte signaal zal nul nadert als de beperking van reactant verzadigd raakt. Montage van de isotherm geeft de thermodynamische parameters. Meerdere reviews beschikbaar die beschrijven de instrumentatie als de wiskunde van de gegevensverzameling en-analyse. 2,3 Terwijl andere calorimeters zijn beschikbaar (met name het ITC 200 met kleine volumes), hier beschrijven we een algemeen protocol voor de VP-ITC vervaardigd door MicroCal (nu onderdeel van GE Healthcare). 1. Voorbereiding van de monsters <ol><li> Met het oog op het macromolecuul en ligand in buffer voor te bereiden, een aantal potentiële problemen moeten worden aangepakt. Nauwkeurige past vereisen de juiste concentraties van het macromolecuul, de soorten die typisch gaat in de steekproef cel van de ITC, en ligand, de soorten in de injectiespuit. Omdat sommige eiwitten samenklonteren aan de hoge concentraties die nodig is voor de soorten in de injectiespuit, is meestal het eiwit geladen in het monster cel. De optimale macromolecuul concentratie wordt bepaald uit &quot;c&quot;, het product van de voorspelde affiniteit van het systeem, die kan worden geschat met behulp van orthogonale methoden voorafgaand aan het gebruik van ICT, en de totale concentratie macromolecuul, waarbij c = K a * [M]. Optimale waarden van c range 10 tot 1000, een al is het mogelijk om accurate gegevens voor zwakke-bindende systemen te krijgen onder specifieke experimentele condities met c-waarden onder de ondergrens. 4 Zo moet de macromolecuul concentratie worden bepaald met deze reeks van c-waarden in het achterhoofd (dat wil zeggen, voor een K een van de 10 6 M -1, macromolecuul concentraties van 10 tot 1000 pm moet worden gebruikt). Voorkennis van de bindingsaffiniteit van het systeem kan helpen bij het minimaliseren van de eiwit gebruikt voor ITC dankzij een beter ontwerp van het ITC-experiment. De concentratie van het ligand groot genoeg moet zijn (7-25 keer meer geconcentreerd dan de K d voor de zwakste ligand-bindende site), zodat de verzadiging optreedt binnen het eerste derde tot de helft van de titratie. Nauwkeurige montage van de gegevens vereist ook de verzadiging van het signaal. Voor systemen met een hogere bindingsaffiniteit, moet een lagere concentratie ligand worden gebruikt om de verzadiging te vermijden te vroeg in de titratie, waardoor onjuiste past geven. Zodra de hitte van verdunning control (dat wil zeggen titratie van ligand in de buffer) is afgetrokken van de titratie, moet de enthalpie bij verzadiging benadering nul. </li><li> Omdat de kleine molecule onzuiverheden kan aanleiding geven tot artefactuele signalen in de ITC-metingen, is het het beste, indien mogelijk, dat het macromolecuul en ligand uitputtend worden gedialyseerd tegen buffer. Als alternatief kan kolomchromatografie, ontzouten spinnen kolommen of buffer ruil centrifugale filters (bijvoorbeeld Centricons) worden gebruikt om de buffer van het macromolecuul te veranderen. Als het ligand is een klein molecuul, kan het worden bereid met behulp van de dialyse buffer na het macromolecuul is gedialyseerd of door het dialyseren tegen dialysemembranen met cutoffs geschikt voor kleine moleculen (dat wil zeggen 100-500 Da voor een Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Verschillen in de samenstelling buffer tussen de ligand en macromolecuul oplossingen kan leiden tot artefacten signaal van de hitte van de verdunning van onzuiverheden in de monsters. Na bereiding, moet u controleren of de pH van de buffer, macromolecuul en ligand wedstrijd (± 0,05 pH-eenheden) als artefacten in de enthalpie kan ontstaan ​​als gevolg van protonatie effecten buffer. 5 Zorg ervoor dat u voldoende voor te bereiden van elke soort. Voor drievoud experimenten en een verdunning controle, zal de hoeveelheid die nodig is materiaal dat afhankelijk van de gebruikte ITC. Maar voor de meeste ITC instrumenten die ongeveer 2 ml monster cellen hebben, zal minimaal 6-7 ml van macromolecuul oplossing nodig is, en kan gemakkelijk worden bereid in 15 ml Falcon buizen. Voor 300 uL injectiespuiten, moet 1-2 ml oplossing voldoende, en kunnen worden bereid in een van beide valk buizen of microcentrifugebuizen. </li><li> Stof en andere deeltjes, kan leiden tot artefacten in de baseline van de ITC thermogram. Het is noodzakelijk dat ze worden verwijderd voordat het runnen van het experiment. Na bereiding van het monster voorraad oplossingen, moeten de monsters worden gecentrifugeerd in microcentrifugebuizen gedurende vijf minuten op 8000 tot 14.000 RPM te pellet deeltjes in de oplossing. Verwijder de bovenstaande vloeistof, zorg dat u de pellet te verstoren, en plaats deze in een nieuwe valk / microcentrifugebuis. Als reductanten zijn nodig om minder cysteines te behouden, gebruik lage concentraties en verse voorraden van β-Mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxyl) fosfine), of dithiothreitol elke artefacten te wijten aan reductant oxidatie te minimaliseren. Ook kan de aanwezigheid van organische oplosmiddelen in de buffer (gemeenschappelijk voor enkele kleine molecule liganden die methanol of DMSO kan nodig zijn om te kunnen worden oplosbare) veroorzaken signaal artefacten. Als organische oplosmiddelen nodig zijn voor het ligand, dan is het macromolecuul oplossing moet bevatten dezelfde concentratie op een signaal als gevolg van de hitte van verwatering van het organische oplosmiddel te vermijden. Kleine verschillen in samenstelling tussen de buffer ligand en macromolecuul te wijten aan cosolvents, zouten of pH zijn mogelijk tijdens de bereiding van de monsters. Het beste is om de verdunning van het ligand inchecken in het monster buffer of het monster buffer in het macromolecuul om ervoor te zorgen dat de warmte-signalen als gevolg van verschillen in de buffer inhoud geen gegevens louter voortkomt uit artefacten veroorzaken. </li><li> Controleer de concentratie van het macromolecuul en ligand zorgvuldig met behulp van technieken geschikt om uw systeem (zoals absorptie metingen, HPLC, colorimetrische assays, BCA assays voor eiwitten, etc) om hun exacte concentratie vast te leggen. Verschillen tussen de werkelijke concentratie en de concentratie wordt gebruikt om de isotherm fit zal leiden tot fouten in de stoichiometrie, enthalpie en bindingsaffiniteit bepaald op basis van het experiment. Het is gebruikelijk om ontgas de monsters om te voorkomen dat het signaal artefacten als gevolg van luchtbellen of het vrijkomen van opgeloste gassen tijdens de titratie, in het bijzonder bij hogere temperaturen. </li></ol> 2. Het opzetten van het Experiment <ol><li> Zorg ervoor dat het monster cel en injectiespuit worden gereinigd volgens de protocol van de fabrikant voor het laden van de macromolecuul en ligand. Spoel het monster cel twee of drie keer met 1,8 ml gedestilleerd water met behulp van de Hamilton spuit (gebruik voorzichtig met de Hamilton spuit als het vat gemakkelijk is gebroken of de naald gebogen). Volgende spoel het monster cel meerdere malen met 1,8 ml buffer. Load het monster cel met 1,8 ml van het macromolecuul oplossing, let daarbij goed op belvorming te voorkomen. </li><li> Vul de referentie-cel met gedestilleerd water. Voor de meeste buffers, gedestilleerd water is prima te gebruiken als de referentie-oplossing. Echter, voor buffers met een bijzonder hoge ionische sterkte of osmolaliteit, is het beter om de buffer te gebruiken als een referentie. </li><li> Verwijder de luchtbellen uit de blanco en de meetoplossing met behulp van de Hamilton spuit. Beweeg de naald van de spuit op-en langs de zijkanten van de cel kloppen eventuele luchtbellen die kunnen worden aan de onderkant van de cel en aan de goed naar de top van de cel. Verwijder overtollig volume van het monster en referentie-cellen. </li><li> Bevestig een plastic injectiespuit om de vulling poort van de injectiespuit met behulp van slangen. Spoel de injectiespuit met gedestilleerd water. Volgen door een buffer te spoelen. Zorg ervoor dat de injectiespuit wordt volledig ontruimd door het opstellen lucht door het systeem. Plaats de naald van de injectiespuit in de ligand-oplossing en trek de ligand oplossing in de injectiespuit totdat de hele spuit vol is. Ga door het tekenen van een klein overschot (ongeveer 50 ul of meer) in de haven en de bijgevoegde buizen. Sluit onmiddellijk de vulling poort van de spuit en verwijder de slang en plastic spuit. Zuiveren en vul de injectiespuit nog twee keer om eventuele luchtbellen te verwijderen van de injectiespuit. Haal de spuit uit de ligand-oplossing en veeg de kant met een kimwipe elke druppels te verwijderen, zorg dat u de spuit touch van de kimwipe omdat dit kan het volume te verwijderen van de injectiespuit. Wees ook voorzichtig niet te kloppen of pot de spuit vast zoals dit ook kan het verlies van volume van de spuit te veroorzaken. Plaats de injectiespuit in het monster cel. </li><li> Stel de parameters voor het uitvoeren van de ITC. Voor de binding systemen met sterke warmte-signalen, zal een groot aantal van de lage volume injecties geven meer datapunten voor de montage van (bijvoorbeeld 75 injecties van 3 pi). Voor systemen die warmte zwakke signalen, een klein aantal grote hoeveelheid injecties de voorkeur (bv. 33 injecties van 8 pi). Meestal worden er minder injecties met hogere volumes injectie gebruikt. Het kan enkele titraties aan de voorwaarden die het beste voor uw systeem te optimaliseren. Het is belangrijk op te merken dat de bindende enthalpie ofwel kan worden exotherme of endotherme, afhankelijk van het systeem dat wordt bestudeerd. Helaas, sommige systemen hebben een lage warmte-signalen, waardoor de warmte van de reactie moeilijk vast te stellen. Problemen met dergelijke systemen kan mogelijk worden ondervangen door het verhogen van de concentratie van het macromolecuul, het veranderen van de temperatuur van het experiment (afhankelijk van de warmtecapaciteit van het bindend systeem), en / of wijzigen van de pH of ionische sterkte van de buffer. </li><li> Ook rekening houden met de tijd die afstand tussen elke injectie. Het is noodzakelijk dat na elke injectie van ligand, het systeem is het tijd om evenwicht gegeven en de warmte signaal terug naar de uitgangswaarde voor de volgende injectie komt. Voor de meeste systemen, drie tot vijf minutes moet voldoende zijn. De tijd tussen de injecties moeten worden verhoogd voor systemen waarbij het evenwicht niet binnen vijf minuten. </li><li> Omdat er een aantal mixen zijn tussen de macromolecuul en ligand-oplossingen in de injectiespuit zodra deze is opgenomen in de steekproef cel, zal de eerste injectie te geven valse resultaten. Het beste is om kleine volumes (bijv. 2 pi) voor het eerst gebruikt een of twee injecties (zodat ze kunnen later worden weggegooid) en de daaropvolgende injecties te houden op de gewenste waarden. </li><li> Kies de temperatuur van het experiment (met 25 ° C is de meest voorkomende, maar temperatuur tussen 2 en 80 ° C kan worden gebruikt). Het is het beste te kiezen voor een temperatuur die andere experimenten (binding, kinetiek, etc.) uitgevoerd op de ligand-macromolecuul systeem wedstrijden. Het ITC kan worden ingesteld in evenwicht bij een temperatuur die afwijkt van de temperatuur van het experiment. Als het experiment zal worden uitgevoerd bij een temperatuur van meer dan 10 ° C verwijderd van kamertemperatuur, dan is het best om het evenwicht temperatuur in te stellen voor het instrument binnen de 5 ° C van de experimentele temperatuur. Dit vermindert de tijd die het instrument zal nemen om de temperatuur van het experiment te bereiken. De roeren snelheid van de spuit moet ook worden overwogen. Roeren is noodzakelijk voor adequate menging van het ligand en macromolecuul tijdens de titratie, maar sommige eiwitten gedestabiliseerd door snel roeren. Voor deze gevallen moet de roersnelheid worden vastgesteld op een relatief laag tarief. Zodra alle experimentele parameters zijn ingesteld, dan is het experiment kan worden gestart. </li><li> Als het experiment eenmaal is voltooid, kan het ITC worden gereinigd volgens protocol van de fabrikant. De oplossing in de steekproef cel aan het einde van het experiment kan worden gehouden als er extra experimenten op het macromolecuul-ligand complex mengsel gewenst zijn. </li><li> Herhaal de titraties ten minste een of twee keer om reproduceerbare gegevens op te halen. Voer een controle waar ligand is in de buffer getitreerd in de steekproef cel om de warmte van de verdunning te bepalen voor de ligand. Voor sommige systemen waar sprake is van coöperatieve binding, extra informatie over de bindende proces kan worden verkregen door het injecteren van het macromolecuul in de ligand. De verschillende oriëntaties injectie kan geven aanvullende informatie, die nuttig zijn voor de wereldwijde montage. 6 </li></ol> 3. Het analyseren van de gegevens <ol><li> Montage van de gegevens kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met behulp van macro&#39;s in alle gegevens die passend programma (meestal geleverd door de fabrikant, samen met het instrument). Laad de eerste gegevens bestand. Controleer de ruwe thermogram op tekenen van luchtbellen of andere artefacten in het signaal. Als er artefacten (zoals pieken in de basislijn of pieken wanneer er geen injectie op dat tijdstip), noteer deze data punten zoals ze zouden moeten worden verwijderd. Vervolgens laadt u de ligand verdunning controle van gegevens, en aftrekken van de ligand verwatering gegevens van de binding isotherm. Op dit moment, verwijdert u alle valse gegevens punten, waaronder de eerste een of twee datapunten van de titratie waar verdunning artefacten optreden (zie stap 7). </li><li> Selecteer de gegevens die passend model (een bindingsplaats, twee / meerdere bindingsplaatsen, coöperatieve binding, etc) worden gebruikt om de data te passen. De gegevens kunnen worden passen bij de initiële schattingen van de fitting parameters, stoichiometrie (n), enthalpie (vermogen DH) en de bindingsaffiniteit (K a). Als voorkennis van de bindingsaffiniteit, of andere parameters, is bekend van orthogonale experimenten, dan zijn deze waarden kunnen worden ingevoerd. Dit helpt voorkomen dat de fit worden gevangen in de lokale minima tijdens de montage. Zodra de gegevens zijn geschikt voor de eerste titratie, herhaalt u de stappen 15 en 16 voor de rest van de isothermen. Als alternatief kunnen de gegevens geschikt zijn wereldwijd met behulp van programma&#39;s zoals SEDPHAT. Zes SEDPHAT kan bijzonder nuttig zijn in de wereldwijde montage van binaire complexe datasets (dwz moleculen A + B) in combinatie met ternaire complexe datasets (moleculen A + B + C). Bijvoorbeeld, in binding van molecuul C tot een AB-complex, is het niet altijd duidelijk of er misschien een signaal zijn voor de binding van C naar A of van B naar A (als A niet volledig verzadigd is). </li><li> Om te verzekeren dat de ITC de gegevens niet kunstmatig zijn, moet de bindingsaffiniteit en stoichiometrie verkregen van ITC worden vergeleken met een orthogonale methode. 7,8 Daarnaast is de ITC enthalpie waarde kan worden vergeleken met de enthalpie van een van&#39;t Hoff plot. 9 Het kan ook nuttig blijken om verschillende concentraties van het ligand of macromolecuul gebruiken als de absolute waarde van de warmte-signaal moeten toenemen met toenemende macromolecuul concentratie. Artefacten zijn het meest waarschijnlijk ontstaan ​​als de buffers in de cel en de spuit zijn niet voor elkaar. Een andere mogelijkheid voor artefacten komt voort uit onzuivere monsters. </li><li> Wij raden de gebruiker beginnen met eenvoudige binaire complex titraties waarvoor er vorige informatie beschikbaar is over K d en stoichiometry. Dan, als extra liganden te binden, kan de gebruiker proberen meer ingewikkelde ternair complex titraties, variëren van de ligand concentraties, en misschien schakelen van de spuit en celonderdelen. Een vergelijking van de enthalpie voor beide paden naar ternair complex ontstaan, moet worden additief als enthalpie is een state-functie. 10 Nogmaals, SEDPHAT 6 is waarschijnlijk hier heel nuttig zijn. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figuur 1. Een representatief voorbeeld van een goed opgevoede titratie voor de binding van de cofactor NADPH te E. coli chromosomale dihydrofolaatreductase (ecDHFR). Panel (A) toont de ruwe thermogram; (B), de binding isotherm van de geïntegreerde thermogram passen met behulp van de een-site model in de Oorsprong software, en (C) de pasvorm van de isotherm het gebruik van de een bindingsplaats model van SEDPHAT langs de met fit residuen. Van de Origin-software, het gebruik van de een site bindend model, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, vermogen DH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, en ΔG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Past van de gegevens met behulp van Sedphat veroorloven een n van 0,94 ± 0,01, een K D van 0,195 ± 0,013 ΔM, een vermogen DH van -22.5 ± 0.2 kcal / mol, TΔS van -13,39 kcal / mol en ΔG van -9,15 kcal / mol.

<ol>
	<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition.">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li><li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride.">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li><li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT:+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling.">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li><li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase,+a+D2+symmetric+protein.">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li><li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides:+calorimetric+and+NMR+characterization.">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li><li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis.">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li><li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+(3)-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System.">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li><li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2008:+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li><li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions.">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li><li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA.">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li><li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles:+a+thermodynamic+study.">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li><li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITC+in+the+post-genomic+era...?+Priceless.">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li><li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane.">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li><li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding.">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li><li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states.">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

ITC wordt veelvuldig gebruikt bij het ​​bestuderen van ligand macromolecuul interacties, 11 met studies kijken naar eiwit-ligand, 12 DNA-ligand 13 en RNA-macromolecuul 14 studies. ITC kan zelfs worden uitgevoerd met vaste stoffen, zoals nanodeeltjes, dat een uniforme suspensies te vormen. 15 Verder ternaire systemen, waarbij een ligand nu al gebonden is aan het macromolecuul en een tweede ligand is getitreerd, kan worden gebruikt om de thermodynamica van te bepalen, voor Zo kan bijvoorbeeld binding van substraat van een enzym-cofactor-systeem. 7 studies ook worden uitgevoerd voor moleculen met een zeer hoge bindingsaffiniteit dat de detectiegrens van de ITC normaal gesproken hoger zijn dan door het uitvoeren van concurrentie bindingstesten met een zwakkere liganden. 16 Informatie over de zwakke binding liganden kunnen ook verkregen worden door de concurrentie assays. 17 De rol van water in binding kan worden onderzocht door ITC, 18 samen met de afhankelijkheid van de enthalpie op solvent reorganisatie. 19 Onlangs werden de thermodynamica van conformationele verandering van DnaK varianten gemeten na binding van ADP en ATP. 20 Eiwit-eiwit vereniging kan worden bestudeerd door ITC, waardoor informatie over hetero-complexen 21 en op homo-vereniging. 22 Temperatuur effecten op de binding enthalpie geeft de warmte capaciteit van de binding evenement. 2 Het aantal protonen geabsorbeerd of vrijgegeven na binding kan ook worden bepaald op basis van experimenten uitgevoerd in buffers met verschillende enthalpie van ionisatie. 5 Als er extra ICT-studies zijn uitgevoerd bij verschillende pH-waarden, dan is de pKa van de betrokken groep kan mogelijk worden bepaald. 23 Samen te vatten, nauwkeurige metingen van de concentratie van het macromolecuul en ligand zijn noodzakelijk voor een goede ITC experiment. Concentraties in het monster moeten ook binnen een juiste bereik om betrouwbare gegevens te krijgen. Voorzichtigheid is geboden met de buffer als kleine molecule onzuiverheden en de pH-mismatches zal artefacten veroorzaken in de thermogram.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> 1,7 ml microcentrifuge buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 tot 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 mL Hamilton spuit </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Isotherme titratie calorimetrie (ITC) is een handig hulpmiddel voor het begrijpen van de thermodynamische volledig beeld van een bindende reactie. In de biologische wetenschappen, macromoleculaire interacties zijn essentieel in het begrijpen van de machinerie van de cel. Experimentele condities, zoals de buffer en temperatuur, kan worden aangepast aan de specifieke binding systeem dat wordt bestudeerd. Echter, is zorgvuldige planning noodzakelijk omdat bepaalde ligand en macromolecuul concentratiebereiken nodig zijn om bruikbare gegevens te verkrijgen. Concentraties van het macromolecuul en ligand moeten nauwkeurig worden bepaald voor betrouwbare resultaten. Zorg moet ook worden genomen bij de voorbereiding van de monsters als onzuiverheden kan een aanzienlijke invloed hebben op het experiment. Bij het ITC experimenten, samen met de controles, goed worden uitgevoerd, nuttige bindende informatie, zoals de stoichiometrie, affiniteit en enthalpie, worden verkregen. Door het uitvoeren van bijkomende experimenten onder verschillende buffer of temperatuur, kan meer gedetailleerde informatie worden verkregen over het systeem. Een protocol voor de basis-setup van een ITC-experiment is gegeven.

Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Acid–Base Titration

SCIENTISTS IN ACTION

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Titratie van de Mens Coronavirussen Met behulp van een immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...