Name: isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Эта работа была поддержана NSF гранта MCB-0817827.

<ol>
	<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition.">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li><li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride.">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li><li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT:+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling.">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li><li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase,+a+D2+symmetric+protein.">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li><li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides:+calorimetric+and+NMR+characterization.">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li><li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis.">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li><li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+(3)-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System.">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li><li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2008:+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li><li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions.">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li><li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA.">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li><li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles:+a+thermodynamic+study.">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li><li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITC+in+the+post-genomic+era...?+Priceless.">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li><li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane.">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li><li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding.">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li><li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states.">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

ITC широко используется в изучении взаимодействий лигандов макромолекулы, 11 с исследований, глядя на белок-лиганд, 12 ДНК-лиганд 13 и РНК-макромолекулы 14 исследований. МТЦ может даже быть запущена с твердыми материалами, такими как наночастицы, которые образуют единый суспензий. 15 Кроме того, тройных системах, где один лиганд уже привязан к макромолекулы и второй лиганд титруют, могут быть использованы для определения термодинамики, для Например, связывание субстрата ферментом кофактора системы 7. Исследования также может быть выполнена для молекул с очень высокой аффинности связывания, которые обычно превышают предел обнаружения ЦМТ путем проведения конкурса обязательные тесты с более слабыми обязательным лигандами. 16 Информация о слабо обязательным лигандов можно получить на конкурсной основе анализов. 17 Роль воды в связывании могут быть изучены МТЦ, 18 наряду с зависимостью энтальпии от растворителя реорганизации. 19 В последнее время термодинамике конформационных изменений вариантов DNAK были измерены при связывании АДФ и АТФ. 20 Белок-белковые объединения может быть изучен МТЦ, что дает информацию о комплексах гетеро 21, а также на гомо-ассоциации. 22 Влияние температуры на энтальпию обязательным даст теплоемкость обязательные мероприятия. 2 числа протоны поглощаются или освобождены от обязательной также может быть определен из экспериментов в буферах с разным энтальпий ионизации. 5 Если дополнительные исследования МТЦ сделаны при различных значениях рН, то рКа группа участвует потенциально может быть определена 23. Подводя итог, точные измерения концентрации макромолекул и лиганда являются обязательными для хорошего эксперимента ЦМТ. Пример концентрациях также должны находиться на расстоянии необходимом диапазоне, чтобы получить достоверные данные. Следует проявлять осторожность с буфером как малые молекулы примесей и рН несоответствие вызовет артефакты в термограммы.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> 1,7 мл труб микроцентрифужных </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 мл сокола труб </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 мл шприца Гамильтона </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Изотермические калориметрии титрования (МТЦ) является полезным инструментом для понимания полной картины термодинамические обязательным реакции. В биологических науках, макромолекулярных взаимодействий имеют важное значение в понимании механизмов клетки. Экспериментальные условия, такие как буфера и температуры, могут быть адаптированы к конкретному обязательным изучаемой системы. Тем не менее, тщательное планирование необходимо, поскольку некоторые лиганда и макромолекулы диапазоны концентрации, необходимые для получения полезной информации. Концентрации макромолекулы и лиганд должны быть точно определены для получения надежных результатов. Уход также должны быть приняты при подготовке образцов в качестве примесей может существенно повлиять на эксперимент. Когда ITC экспериментов, наряду с элементами управления, выполняются должным образом, полезные сведения о привязке, например, стехиометрии, близость и энтальпии, получены. При запуске дополнительных экспериментов при различных буфера или температурные условия, более подробную информацию можно получить о системе. Протокол для базовой настройки эксперимента ITC дается.

Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Общий протокол для использования изотермической калориметрии титрования для контроля обязательными термодинамики для биологических систем с умеренной аффинности связывания представлена.

Изотермические калориметрия титрования для измерения Макромолекулярно-лиганд Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Acid–Base Titration

SCIENTISTS IN ACTION

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Титрование по правам Коронавирусы Использование Иммунопероксидазное Пробирной

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Сбор переменной концентрации Изотермические наборов калориметрия титрования с целью определения обязательных механизмов

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Биохимический Титрование гликогена<em&gt; В пробирке</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity основе Выделение Tagged ядер от<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Ткани для анализа экспрессии генов

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; АТФазы для ферментативного определения характеристик

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Настраиваемая камера для измерительной ячейки миграции

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...