Name: isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Bu çalışma, NSF hibe MCB-0817827 tarafından desteklenen oldu.

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bir deneyde bağlayıcı bir etkileşim tüm termodinamik parametreler (yakınlık, entalpi ve stokiyometri) belirleyebilirsiniz iyi kurulmuş teknik, izotermal şartlar altında ikinci bir reaktanı bir reaktanı titre 1 ITC çalışır . Ölçülen sinyal iki reaktanları etkileşimi üzerine serbest (bağlama) veya emilen ısı. Bir dizi enjeksiyon yapılır ve ısı sinyali sınırlayıcı reaktanı doygun hale sıfır yaklaşım olacaktır. Izoterm Montaj termodinamik parametreleri verir. Bazı değerlendirmeleri enstrümantasyon yanı sıra veri toplama ve analiz matematik anlatan kullanılabilir. 2,3 diğer kalorimetreleri mevcut olmakla birlikte (en önemlisi küçük hacimleri ile ITC 200), biz burada genel bir protokol VP-ITC için imal tarif MicroCal tarafından (artık GE Healthcare parçası). 1. Hazırlanması Örnekleri <ol><li> Tampon makromolekül ve ligand hazırlamak için, bazı olası sorunları ele alınması gerekir. Doğru uyan makromolekül uygun konsantrasyonları, genellikle örnek ITC hücre ve ligand gider türleri, enjeksiyon şırınga tür gerektirir. Çünkü bazı proteinler enjeksiyon şırınga türler için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda agrega protein, çoğu zaman örnek hücre içine yüklenir. Optimal makromolekül konsantrasyon ITC kullanmadan önce ortogonal yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir &quot;c&quot;, sistemin tahmin edilen benzeşim ürünü, ve toplam makromolekül konsantrasyonu belirlenir c = K a * [M]. C aralığı 10-1000, 1 Optimal değerler alt sınırının c değerleri ile belirli deneysel koşullar altında zayıf bağlama sistemleri için doğru veri elde etmek mümkün olsa Böylece 4 makromolekül konsantrasyonu bu aralığın ile tespit edilmelidir c akılda değerleri (yani, bir K 10 6 M -1, 10 1000 mcM makromolekül konsantrasyonlarda kullanılması gerekir). Afinitesi sistem hakkında önceden bilgi sahibi ITC deneyi daha iyi bir tasarım ile ITC için kullanılan protein en aza indirmeye yardımcı olabilir. Bu doygunluk titrasyon yarısı ilk üç içinde meydana gelir ligand konsantrasyonu (7-25 kat zayıf ligand bağlanma yeri için K d daha konsantre) kadar büyük olmalıdır. Verileri doğru uydurma da doygunluk sinyali gerektirir. Yüksek afinitesi olan sistemler için, daha düşük bir ligand konsantrasyonu yanlış uyan verecek, çok erken titrasyon doygunluğunu önlemek için kullanılmalıdır. Bir kez seyreltme kontrol ısı (yani tampon içine ligand titrasyon) titrasyon çıkarılır, doygunluk entalpi sıfır yaklaşım gerekir. </li><li> Küçük molekül kirleri ITC ölçümleri artefakt sinyaller ortaya çıkmasına neden olabilir, çünkü makromolekül ve ligand ince ayrıntısına kadar tampon karşı diyalize olması, mümkünse, en iyisidir. Alternatif olarak, kolon kromatografisi, dönüş sütun tuzsuzlaştırma, ya da tampon değişimi santrifüj filtreleri (örneğin, Centricons) makromolekül tampon değiştirmek için kullanılabilir. Ligand küçük bir molekül ise, makromolekül küçük moleküller için uygun (yani 100-500 Da Spectra / Por Float-A-Lyzer kesilecek Diyaliz membranları karşı diyaliz diyaliz veya edildikten sonra diyaliz tampon kullanılarak hazırlanmış olabilir .) Ligand ve macromolecule çözümler arasında tampon kompozisyonu farklılıklar örneklerde safsızlıkların seyreltme ısı eserler sinyal yol açabilir. Hazırlandıktan sonra, entalpi gölgeleri, tampon, makromolekül ve ligand maç pH (± 0.05 pH birimi) tampon protonasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkabilir emin olmak için kontrol edin. 5 her tür yeterince hazırlamak için emin olun . Üç nüsha deney ve seyreltme kontrolü için gerekli malzeme miktarı, kullanılan ITC bağlıdır. Ancak, yaklaşık 2 ml hacimli numune hücreleri en ITC enstrümanlar için makromolekül çözüm en az 6-7 ml gereklidir olacak ve 15 ml şahin tüpleri uygun hazırlanmış olabilir. 300 mcL enjeksiyon şırınga için, 1-2 ml çözüm yeterli olmalı ve şahin tüpler veya mikrosantrifüj tüpleri ya da hazırlanmış olabilir. </li><li> Toz ve diğer partiküller, ITC değeri şekilden temel eserler neden olabilir. Bu deney çalıştırmadan önce çıkarılmasını zorunludur. Örnek stok çözümleri ön hazırlıktan sonra, numuneler, 8000 çözüm pelet parçacıklar 14.000 RPM için beş dakika mikrosantrifüj tüpler santrifüj edilmelidir. Süpernatantı pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak ve yeni bir Şahin / mikrosantrifüj tüp içine koyun. Reductants azaltılmış cysteines korumak için gerekli ise, β-Merca düşük konsantrasyonlarda ve taze stokları kullanınptoethanol, TCEP (tris (2-karboksil) fosfin) veya dithiothreitol indirgeyici oksidasyon nedeniyle herhangi bir eser en aza indirmek için. Ayrıca, organik çözücüler (çözünür için metanol veya DMSO gerekebilir bazı küçük molekül ligandlar için ortak) varlığı tampon sinyali eserler neden olabilir. Eğer organik çözücüler ligand için gerekli olan, daha sonra makromolekül çözüm organik çözücü seyreltme sıcaktan kaynaklanan herhangi bir sinyal önlemek için de aynı konsantrasyonu içermelidir. Ligand cosolvents nedeniyle makromolekül arasındaki tampon bileşimi hafif farklılıklar, tuz veya pH örneklerinin hazırlanması sırasında mümkündür. Makromolekül içine örnek tampon veya numune tamponu içine tampon içerik farklılıklardan kaynaklanan ısı sinyalleri sadece kalıntılarından kaynaklanan veri neden olmamasını sağlamak için seyreltme ligand kontrol etmek en iyisidir. </li><li> Dikkatlice tam konsantrasyonları kayıt sistemine uygun teknikleri (absorbans ölçümleri, HPLC, kolorimetrik testleri, proteinler için BCA testleri, vb gibi) kullanarak makromolekül ve ligand konsantrasyonları kontrol edin. Izoterm sığdırmak için kullanılan gerçek konsantrasyon ve konsantrasyonu farklılıklar stokiyometri, entalpi ve deney belirlenen afinitesi hatalarına neden olur. Bu, özellikle yüksek sıcaklıklarda hava kabarcıkları veya titrasyon sırasında çözünmüş gazları salınımı nedeniyle sinyal eserler, önlemek için gazını örnekleri yaygındır. </li></ol> 2. Deney ayarlama <ol><li> Örnek hücre ve enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand yükleme önce üretici firmanın protokolüne göre temizlenir emin olun. Örnek hücresi, iki veya üç kez 1.8 ml distile su Hamilton şırınga (varil kolayca kırık olarak Hamilton şırınga veya iğne bükük ile dikkatli) kullanarak ile durulayın. Sonraki tampon 1.8 ml örnek hücre birkaç kez yıkayın. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olmak, macromolecule çözüm 1.8 ml örnek hücre yükleyin. </li><li> Referans hücre saf su ile doldurun. En tamponlar için, distile su referans çözüm olarak kullanmak için iyidir. Ancak, özellikle yüksek iyonik güçlü veya osmolalitesi tamponlar, tampon bir referans olarak kullanmak daha iyidir. </li><li> Hamilton şırınga yardımıyla referans ve örnek hücreleri hava kabarcıklarını çıkarın. Şırınga, iğne, hücrenin altındaki ve hücrenin en iyi ekli herhangi bir kabarcıkları vurma hücre kenarları yukarı ve aşağı yavaşça hareket. Örnek ve referans hücreler herhangi bir aşırı ses çıkarın. </li><li> Plastik bir enjektör boru kullanarak enjeksiyon şırınga doldurma bağlantı noktasına takın. Enjeksiyon şırınga saf su ile durulayın. Durulama tarafından bir tampon uygulayın. Enjeksiyon şırınga sistemi aracılığıyla hava çekerek tamamen boşaltılmış olduğundan emin olun. Tüm şırınga dolana kadar ligand çözüm içine enjeksiyon şırınga iğnesi enjeksiyon enjektör içine yerleştirin ve ligand çözümü çizmek. Liman ve ekli boru içine biraz fazla hacmi (yaklaşık 50 ul veya daha fazla) çizmeye devam. Hemen şırınga doldurma portu kapatmak ve boru ve plastik şırınga ayırmak. Şırınga herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için Temizle ve dolum enjeksiyon şırınga iki kez daha. Ligand çözüm şırınga çıkarın ve bu şırınga ses çıkarabilir kimwipe şırınga ucu dokunmamaya dikkat ederek, kimwipe herhangi bir damla kaldırmak için bir yan silin. Ayrıca, bu da şırınga ucu hacim kaybına neden olabilir şırınga vurmayın veya kavanoza dikkatli olun. Örnek hücre içine enjeksiyon şırınga yerleştirin. </li><li> ITC çalıştırmak için parametreleri ayarlayın. Güçlü ısı sinyalleri ile bağlayıcı sistemler için, düşük hacimli enjeksiyonlar çok sayıda montaj için daha fazla veri noktaları (örneğin 3 ul 75 enjeksiyon) verecektir. Zayıf ısı sinyallerini sahip sistemler için, az sayıda büyük hacimli enjeksiyonlar (8 ul örneğin 33 enjeksiyon) tercih. En sık olarak, yüksek enjeksiyon hacimleri ile daha az enjeksiyonlar kullanılır. Bu sizin sisteminiz için en iyi koşulları optimize etmek için birkaç titrasyonları sürebilir. Bağlayıcı entalpi çalışılan sisteme bağlı olarak, ekzotermik yada endotermik olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bazı sistemler, ısı tepki belirlemek zor hale, düşük ısı sinyalleri var. Potansiyel olarak bu tür sistemleri ile ilgili problemler, makromolekül konsantrasyonu artırarak, değişen sıcaklık deneyi (bağlama sistemi ısı kapasitesine bağlı olarak), ve / veya pH değerini değiştirerek veya tamponun iyonik gücü tarafından aşılabilir. </li><li> Ayrıca her enjeksiyon arasındaki zaman aralığı göz önünde bulundurun. Ligand, her enjeksiyondan sonra, sistem denge sağlaması için süre verilir şarttır ve sonraki enjeksiyon meydana gelmeden önce ısı sinyali başlangıca döner. Çoğu sistemde, 3-5 minutes yeterli olmalıdır. Enjeksiyonlar arasındaki süre, dengeleme beş dakika içinde oluşmaz sistemleri için artırılması gerekmektedir. </li><li> Örnek hücre içine eklenir kez enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand çözümleri arasında biraz da karışıklık olacağı için, ilk enjeksiyon sahte sonuçlar verecektir. Bu ilk bir veya iki enjeksiyon (bu yüzden daha sonra iptal edilebilir) için küçük hacimli (örneğin 2 ul) ve istediğiniz değerleri sonraki enjeksiyonlar tutmak en iyisidir. </li><li> Deney sıcaklığı (25 ° C arasındaki sıcaklıklarda 2 ile 80 ° C kullanılabilmesine rağmen, en yaygın olarak). Seçin Ligand makromolekül sistemi üzerinde yapılan diğer deneylerin (bağlama, kinetiği, vb.) Eşleşen bir sıcaklık seçmek için en iyisidir. ITC deney sıcaklığı farklı bir sıcaklıkta dengeye kurulabilir. Deney fazla 10 ° C uzakta oda sıcaklığında bir sıcaklıkta olacak ise, o zaman 5 ° C deneysel sıcaklık içinde araç dengeleme sıcaklığını ayarlamak için iyi. Bu cihaz deney sıcaklığına ulaşmak için alacaktır zaman azalacaktır. Şırınga karıştırma hızı da göz önüne alınması gerekiyor. Karıştırma titrasyon sırasında ligand ve makromolekül yeterli karıştırma için gerekli, ancak bazı proteinler hızlı karıştırarak istikrarsızlaştırdı. Bu gibi durumlar için, karıştırma hızı nispeten düşük bir oranda ayarlanmış olmalıdır. Bir kez tüm deneysel parametreleri, daha sonra deney başlamış olabilir kurmak olmuştur. </li><li> Deney bittikten sonra, ITC, üretici firmanın protokolüne göre temizlenir. Makromolekül-ligand kompleks karışımı ilave deneyler istendiğinde, deney sonunda örnek hücre çözüm tutulabilir. </li><li> Titrasyonları tekrarlanabilir verileri almak için en az bir ya da iki kez daha tekrarlayın. Ligand ligand için seyreltme ısı belirlemek için örnek hücre içine tampon titre edilir bir kontrol çalıştırın. Bazı sistemler için bağlayıcı süreci hakkında kooperatif bağlama, ek bilgi yoktur makromolekül ligand içine enjekte edilerek elde edilebilir. Farklı enjeksiyon yönelimleri küresel montaj için yararlı olabilir ek bilgi verebilir. 6 </li></ol> 3. Veri analizi <ol><li> Veri Montaj kolayca herhangi bir veri montaj programı (genellikle cihaz ile birlikte üretici tarafından sağlanan) makrolar kullanılarak yapılabilir. Ilk veri dosyası yükleyin. Herhangi bir işaret sinyal hava kabarcıkları veya diğer eserler için ham değeri şekilden kontrol edin. (O zaman noktasında herhangi bir enjeksiyon vardı temel ya da zirveleri ani gibi) herhangi bir eser varsa, bunlar kaldırılacak olması gerektiği gibi, daha sonra bu veri noktalara dikkat. Sonra, ligand seyreltme kontrol verileri yük ve ligand bağlayıcı izoterm seyreltme veri çıkarma. Şu anda, seyreltme eserler meydana gelen titrasyon ilk bir veya iki veri noktası (7. adıma bakınız) dahil olmak üzere, tüm sahte veri noktaları çıkarın. </li><li> Verilerin sığması amacıyla kullanılmak üzere veri uydurma modeli (bir bağlanma yeri, iki / çoklu bağlayıcı siteleri, kooperatif bağlama, vb.) Seçin. Verileri (K), uydurma parametreleri, stokiyometri (n), entalpi (ΔH) ve bağlanma afinitesi ilk tahmin uygun olabilir . Afinitesi veya diğer parametreler önceden bilgi, dik deneyler bilinen ise, bu değerler girilebilir. Bu uydurma sırasında yerel minimum sıkışıp haline uyum uzak durmanıza yardımcı olur. Veri ilk titrasyon için uygun edildikten sonra, geri kalanı için izotermleri 15 ve 16. adımları tekrarlayın. Alternatif olarak, veriler, dünyada bu tür SEDPHAT programları kullanarak uygun olabilir 6 SEDPHAT üçlü karmaşık veri setleri ile birlikte ikili karmaşık veri setleri (yani moleküller A + B) küresel uydurma özellikle yararlı olabilir (moleküller A + B + C) . Örneğin, bir AB karmaşık molekül C bağlayıcı (tam doymuş değilse) A ya da B, C bağlayıcı nedeniyle herhangi bir sinyal olabilir mi her zaman açık değildir. </li><li> ITC verileri artefakt olduğundan emin olmak için, afinitesi ve ITC elde stoichiometries dik bir yöntem ile karşılaştırıldığında olmalıdır. 7,8 Ayrıca, ITC van&#39;t Hoff arsa entalpi entalpi değeri mukayese edilebilir. 9 Ayrıca, artan macromolecule konsantrasyon ile ısı sinyali mutlak değerini artırmak gerektiği gibi ligand veya makromolekül farklı konsantrasyonlarda kullanmak yararlı olabilir. Eserleri, hücre ve şırınga tamponlar uyumlu değilse ortaya çıkması en muhtemel. Eserler için bir başka olasılık saf örnekleri ortaya çıkar. </li><li> Biz K d ve stoich önceki bilgi yoktur kullanıcı için basit bir ikili karmaşık titrasyonları ile başlamanızı öneririziometry. Daha sonra, eğer ek ligandlar bağlayan, kullanıcı ligand konsantrasyonları farklı, daha karmaşık bir üçlü kompleksi titrasyonları deneyebilirsiniz, ve belki de şırınga ve hücre bileşenleri anahtarlama. Entalpi bir devlet fonksiyonu olarak, hem de yolları için üçlü kompleks oluşum entalpisi bir karşılaştırma katkı olmalıdır. 10, SEDPHAT 6, burada oldukça yararlı muhtemeldir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Şekil 1. E. NADPH kofaktör bağlama için iyi davranmış titrasyon bir temsilci örnek coli kromozom dihidrofolat redüktaz (ecDHFR). Paneli (A), ham değeri şekilden gösterir; (B), entegre değeri şekilden uyum bağlayıcı izoterm Kökeni yazılım bir yerinde modeli kullanarak ve (C) boyunca SEDPHAT izoterm uygun bir bağlayıcı site modeli kullanılarak fit artıklar. Kökeni yazılımı, tek bir site bağlama modelini kullanarak, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0.194 ± 0.001 mcM, H = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / mol ve işaretiyle karar verilir = - 9.16 ± 0.01 kcal / mol. Sedphat 0.94 n göze kullanarak veri uyar ± 0.01, 0.195, K d ± 0.013 ΔM, bir ΔH -22.5 ± 0.2 kcal / mol, -13,39, TΔS kcal / mol ve -9,15 kcal / mol, işaretiyle karar verilir.

<ol>
	<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition.">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li><li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride.">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li><li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT:+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling.">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li><li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase,+a+D2+symmetric+protein.">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li><li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides:+calorimetric+and+NMR+characterization.">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li><li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis.">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li><li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+(3)-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System.">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li><li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2008:+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li><li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions.">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li><li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA.">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li><li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles:+a+thermodynamic+study.">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li><li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITC+in+the+post-genomic+era...?+Priceless.">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li><li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane.">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li><li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding.">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li><li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states.">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

ITC ligand makromolekül etkileşimleri, 11, 12 DNA-13 ve RNA makromolekül 14 çalışma ligand, protein-ligand bakarak çalışmaları ile eğitim yaygın olarak kullanılan olmuştur . ITC bile üniforma süspansiyonlar formu gibi nanopartiküller gibi sağlam malzemeler, Ayrıca 15, bir ligand zaten makromolekül bağlı ve ikinci bir ligand titre üçlü sistemler, termodinamik belirlemek için kullanılabilir, Örneğin, bir enzim kofaktör sistemi substrat bağlanması 7 Araştırmalar aynı zamanda, normalde zayıf bağlayıcı ligandlar ile rekabet bağlayıcı deneyleri yaparak ITC algılama sınırını aşacak çok yüksek bağlanma afiniteleri ile moleküller için yapılabilir. 16 zayıf bağlayıcı Bilgiler son 19 ligandlar rekabet analizleri ile de elde edilebilir. 17 su bağlama rolü çözücü yeniden yapılanma entalpi bağımlılığı ile birlikte, 18 ITC tarafından keşfedilmeyi olabilir. DNAK varyantlarının konformasyonel değişim termodinamik bağlayıcı üzerine ölçüldü ADP ve ATP bağlayıcı entalpi 20 protein-protein birliği hetero kompleksleri 21 homo-dernek hakkında bilgilerin yanı sıra verimli, ITC tarafından incelenecektir. 22 Sıcaklık etkileri bağlayıcı olay ısı kapasitesi 2 numara verecektir. ek ITC çalışmaları farklı pH değerlerinde yapılırsa proton emilir veya bağlayıcı üzerine yayımlanan iyonizasyon farklı entalpisi ile tampon yapılan deneyler de tespit edilebilir. 5 pKa katılan grup, daha sonra potansiyel olarak tespit edilebilir. 23 Özetlemek gerekirse, makromolekül ve ligand konsantrasyonu iyi bir ITC deneyi için doğru ölçümler zorunludur. Örnek konsantrasyonları da güvenilir veri elde etmek için uygun bir aralık içinde olması gerekir. Küçük molekül kirlilikler ve pH uyumsuzlukları değeri şekilden gölgeleri neden olacaktır Bakım tamponu ile alınmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 1.7 mL mikrosantrifüj tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml şahin borular </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2.5 mL Hamilton şırınga </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bağlayıcı bir reaksiyon termodinamik resim anlamak için yararlı bir araçtır. Biyolojik bilimler, makromoleküler etkileşimleri hücre makine anlamak çok önemlidir. Tampon ve sıcaklık gibi deneysel koşullar, çalışılan belirli bir bağlama sistemi için uygun olabilir. Ancak, belirli bir ligand ve makromolekül konsantrasyon aralıkları yararlı veriler elde etmek için gerekli olduğundan, dikkatli bir planlama gereklidir. Makromolekül ve ligand konsantrasyonları güvenilir sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde tespit edilmesi gerekmektedir. Bakımı da kirleri deney önemli ölçüde etkileyebilir örnekleri hazırlanırken alınması gerekir. Stokiyometri, yakınlık ve entalpi gibi kontrollerle birlikte ITC deneyleri, doğru yapılır, yararlı bağlama bilgileri, elde edilir. Farklı tampon veya sıcaklık koşulları altında ilave deneyler çalıştıran, sistemi hakkında daha ayrıntılı bilgi elde edilebilir. ITC deneyi temel kurulum için bir protokol verilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Acid–Base Titration

SCIENTISTS IN ACTION

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...