Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
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Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R21MH082360 (BGC) und R01HD056315 (NRM) sowie der University of Georgia unterstützt.

1. Riboprobe Generation über In-vitro-Transkription <ol><li> Vorbereitung PCR-Produkte für in-vitro-Transkription Vorlagen. <ol><li> Designing PCR-Primer mit Phagen Transkription Promotor-Sequenzen in ihren 5&#39;-Enden. Hinweis: Die Promotorsequenz hinzugefügt, um der Sense-Strang-PCR-Primer 5&#39;-Ende wird zum Aufzeichnen der Sense-Sonde verwendet werden, und die Promotorsequenz hinzugefügt, um der Antisense-PCR-Primer 5&#39;-Ende wird für die Synthese des anti-sense-S...

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	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

Die Methoden in diesem Protokoll beschriebenen aus einer Reihe von unterschiedlichen Quellen angepasst und optimiert für die ganze Berg E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen. Methoden für die whole mount in situ Hybridisierung von Wirbeltierembryonen erschien erstmals in den frühen 1990er Jahren 2,5-12. Dieses Protokoll wurde in erster Linie von Methoden für Xenopus Embryonen 7,8 sowie Maus 2,11 entwickelt angepasst. In unserem Protokoll viel Wert auf eine sorgfältige Bewert...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-Uridin-5&#39;-Triphosphat </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleosid Triphosphat Set </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns für radioaktiv markierte RNA Aufreinigung </td><td> Versorgung </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 Ci </td><td> Reagens </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I rekombinante RNase-freie </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, farblose bis weiße Kristalle oder kristallines Pulver </td><td> Reagens </td><td> Fischer </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel-Ladepuffer </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Versorgung </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Ausstattung </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonat </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparin-Natrium </td><td> Reagens </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid 30% in Wasser </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 8% EM grade </td><td> Reagens </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Mit Vorsicht nach Herstellung der Anleitung </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Machen Sie sich in 5% Aktien und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Machen Sie als 10 mg / ml Lager und bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisol Hydrochlorid </td><td> Reagens </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Torula Hefe, Typ VI </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> Phenol / Chloroform extrahiert mehrmals und ausgefällt, erneut in DEPC-dH2O und bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, ausfällt. Ready-to-use Lösung. </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4ml, Clear, Closed Top, Lagervial Convenience Kit </td><td> Versorgung </td><td> Nationale wissenschaftliche </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake n Bake Hybridisierungsofen </td><td> Ausstattung </td><td> Boekel Scientific </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 bis 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus-Gewebe Einbettmedium </td><td> Reagens </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way Einweg-Kunststoff-Gewebe Einbettformen </td><td> Versorgung </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Plus-Objektträger </td><td> Versorgung </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagens </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine sehr informative Ansatz für die Definition Genexpressionsmuster in Embryonen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren sind langwierig und technisch anspruchsvolle mit mehreren wichtigen Schritten, die gemeinsam die Qualität des Endergebnisses beitragen. Dieses Protokoll beschreibt im Detail einige wichtige Qualitätskontrolle Schritte zur Optimierung Sondenmarkierung und Leistung. Insgesamt bietet unser Protokoll eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte notwendig, um reproduzierbar zu erhalten qualitativ hochwertige Ergebnisse. Zunächst beschreiben wir die Erzeugung von Digoxigenin (DIG) markierten RNA-Sonden über In-vitro-Transkription der DNA-Templates mittels PCR generiert. Wir beschreiben drei kritischen Qualitätskontrolle Assays, um die Menge, die Integrität und die spezifische Aktivität des DIG-markierten Sonden zu bestimmen. Diese Schritte sind für die Erzeugung einer Sonde eine ausreichende Empfindlichkeit, um endogene mRNAs in einer ganzen Maus-Embryo erkennen wichtig. Darüber hinaus beschreiben wir für die Fixierung und Lagerung von E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen für die in-situ-Hybridisierung. Dann beschreiben wir detailliert Methoden für begrenzte Proteinase K Verdau der rehydriert Embryonen durch die Details der Hybridisierungsbedingungen, post-Hybridisierung wäscht und RNase-Behandlung, um nicht-spezifische Sonden-Hybridisierung zu entfernen. Ein AP-konjugierte Antikörper verwendet, um die markierten Sonde visualisieren und zeigen die Expressionsmuster der endogenen Transkript. Repräsentative Ergebnisse sind aus der erfolgreichen Experimente und typische suboptimal Experimente gezeigt.

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Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Das ganze Berg<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung Protokoll diskutiert kritische Schritte, die reproduzierbar hohe Qualität der Ergebnisse zur Genexpression Studien in E8.5-E11.5 Tage alten Maus-Embryonen zu gewährleisten.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

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